核医学分子核医学.ppt

核医学分子核医学
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定义：分子生物学与实验核医学结合…。
内涵：利用示踪技术观察体内的生化过程并与相关基因联系起来的一门分支学科，分子识别是其重要理论基础。
研究领域：受体显像
dNTP参入到DNA分子中达到标记作用。
将32P—dNTP参入到DNA分子中达到标记作用。
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3、核酸标记的检测
核酸标记方法很多，虽已大部分商品化和标准化，但环节繁杂，试剂质量及操作等影响因素多，标记完成后应定性、定量检测。
参入核酸中的cpm
主要两个指标：参入比= -----------------------100%
加入的标记品总cpm
比活性：指每微克核酸中的放射性计数
cpm/μgDNA(RNA)
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4、核酸标记注意事项：
1）同位素的安全防护
2）核酸原料一般用50-150ng，越少，产品比活度越高。
3）标记前体32P-dNTP，用时须真空抽干
4）使用的Ependoff管和吸头需先硅化、防止吸附。
5）标记物应及时用，-20℃可保存1~3天
6）严格按厂家说明书操作，最好做预实验。
7）个别标记方法标记前需做DNA变性处理。
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（二）核酸分子杂交技术
定义：具有一定同源性的核酸单链在一定条件下按硷基互补原则形成异源双链的过程。
杂交步骤：核酸探针与核酸样品（处理好的）混合→反应→漂洗→ARG or测量→分析。
固相杂交：
1）Southern印迹杂交：P277、查DNA序列，分析基因结构、并进行定性、定量研究。
步骤：提取DNA→酶解DNA→琼脂糖电泳→转移硝酸纤维膜上并固定→杂交→ARG
2）Nothern印迹杂交法：主要查RNA序列，步骤大致同上。
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3）斑点杂交：将变性的DNAorRN点样在硝酸纤维膜上，然后杂交，ARG。
4）反向斑点杂交：将多种未标记的已知序列寡核苷酸探针点样于纤维膜，再将待分析的DNA用放素标记后与其杂交，ARG根据杂交点判断DNA序列。P278
5）菌落、噬菌斑原位杂交：将微生物点于纤维素膜或贴印方式转移微生物，曝露细胞DNA，硷化DNA变性，并固定，再进行斑点杂交过程。
6）组织、细胞原位杂交：将组织切片或细胞固定在玻片上，用已知的标记核酸探针进行杂交。
特点；不需以细胞中提取DNAorRNA，通过ARG在显微镜下观察银颗粒，进行定位、定性研究，定位准。敏感性高，对含量极低的靶序列也可检测。
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注：如原位杂交采用非放探针，可染色显微观察。
液相杂交：
将变性的单链核酸与探针在溶液中自由杂交，适当方法分离获得杂交分子、测放了解其特定序列的信息。
特点：
1）受检的目标核酸与示踪的标记核酸均不在支持相上。
2）主要用于基因筛选和将基因组中重复的序列与单一序列分离出来。
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（三）DNA序列分析
DNA序列分析的两个基本步骤
DNA片段的制备的扩增
测定 DNA序列
  PCR测序分析：利用一对高特异性引物，可以直接从基因文库中原始克隆或从极复杂的基因组DNA中，通过不对称PCR反应制备特定基因片段为测序模板（单链DNA），然后用双脱氧法完成序列分析。
双脱氧法 指当有双脱氧核糖核苷三磷酸ddNTP参入时，链的延长就终止，可以得到一系列长度不同的核酸片段，由于4种原料dNTP中有一种是标记的，所以可通过ARG，从图上读出被测DNA的硷基排列序列。
常用方法：未端终止法 化学法 P280
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（四）重组DNA和基因工程
重组DNA基因克隆（基因工程）：指采用分子生物学技术在试管内有目的地切割分离纯化或人工合成的DNA分子和相应的载体，并将其拼接成重组DNA后导入合适的宿主细胞中，使之大量扩增形成克隆，并表达基因产物。
基因工程的基本步骤：P282了解
与核医学相关技术基因诊断：核酸分子杂交技术中用的放素，主要包括遗传性疾病、癌基因与抗癌基因的研究。
（五）聚合酶链反应PCR P284 了解
（六）蛋白质合成中的核技术应用 P287了解
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（七）半抗原标