WB灰度值测定.docx

word
word
1 / 11
word
Image J测到了WB条带灰度值
关于用Image J量化westernblot条带灰度值，在网上一直盛传着两种操作方法，然鹅～小伙伴们却一直不确定到底哪种才是正确的测量灰度方法，甚至度值，但用来量化WB条带都是OK的。
 Image J这个软件在将western blot条带量化时存在两种参数：灰度与光密度（假，暂且这么称呼，原因下文再说），这两者在理解使用Image J量化WB条带十分重要，请务必仔细看以下几个概念。
word
word
4 / 11
word
1、灰度(gray)：是指图像中各种颜色的深浅程度, 它以整数值表示, 一般的图像分析软件将图像每个像素点的颜色分为 0-255共 256 级，每一像素点对应的数值即灰度，灰度值越小物体颜色越深。有兴趣的小伙伴，可以随意用Image J打开一图片，光标在图片上任意移动，得到的value值最小为0（纯黑），最大为255（纯白）。
2、光密度(OD，真)：也就是吸光度（A）, 光线通过溶液或某一物质前的入射光强度Io与该光线通过溶液或物质后的出射光强度Ib比值的对数OD=lg（Io/Ib），其实就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比尔定律。
明确这两个概念后，我们再来看为什么称Image J里的光密度是“假”，因为在图像分析中的光密度（假）是由灰度值再经计算得到的, 它是一个相对值, 但其算法与 OD 值的算法类似。只是它的入射光强度由Western blot胶片上最亮区域的平均灰度值代替, 而出射光强度则由待测目标平均灰度值代替。即:图像分析系统的光密度值=lg(WB胶片上最亮区域的平均灰度值/ 待测目标的平均灰度值)，再简单点来说，就是光密度（假）和正儿八经的灰度值有血缘关系。
总结起来说灰度与光密度（假）都能用来量化western blot条带，两种量化任君随意挑。
现在说回两种操作方法：
方法一：
是通过每个条带上众多像素点对应的灰度值勾画出一条曲线，最后魔棒点出算出的area值其实就是该条带所对应的面积大小。条带越大，area值越大。
方法二：
word
word
6 / 11
word
是通过上文说到的光密度（假）计算方法得出来的，最后得出的Intden值是所圈面积下的总光密度值，再除以圈下面积area，得出的是平均光密度值（图像中阳性区域每一像素点的 OD 值叠加后除以测量的面积）。条带（颜色反转后）越白越亮则Intden/area越大。
所以严格意义上来说，方法一方法二最后得出的数据都不属于正儿八经的灰度值，但又与灰度值有着千丝万缕的联系。如果只是量化WB条带，两种方法是都能选用的，记得标注你得到的结果是area还是Intden，但如果你想测出真正的灰度值，那么我们下节课再来好好谈谈，咦？我说话怎么越来越像老师的风格呢，哈哈，同学们，下课.
今天主要讲述如何用photoshop测量WB灰度值，在讲述操作方法之余，小石头先给大家理一理原理，以便大家更好的理解（文末附操作方法）。
照例最先展示下最后的成果图（其实最后可以用Graphpad做图，在此不赘述）：
好了，开始今天的课程，现在手里有这样的WB条带图， 如何将各条带灰度值测量出来？
首先我们从基本原理聊起，图片大小的存储基本单位是字节，每个字节是有8个比特（bit，音译为比特，也称为“位”）组成。一般的图片都是由众多像素点构成的，灰度模式下一个像素一个字节，也同时就是8bit。在上一堂课中，我们曾用Image J将图片转化为灰度图，就是通过image→type→8-bit这一步。如果把黑-灰-白连续变化的灰度值量化为256个灰度级，灰度值的围也就为0-255，表示亮度由深到浅。
word
word
6 / 11
word
从上图我们可以得知纯黑为0，纯白为255，中间0-255代表各个不同亮度等级。
而通常我们所得到的WB图片是这样的：
前者A是没有转化为灰度模式的，后者B是灰度模式下的。而在灰度模式下，如果按灰度值描述的话，显然有明显条带的的灰度数据基本都与0相近，数值很小，这样不利于互相比较。所以通常的做法是进行“反相”，也就是将白的地方变为黑，黑的地方变为白，颜色颠倒。也就是这样：
至此条带上的灰度值就成了越亮越白则灰度值越大（有没有小伙伴看过那种原始照片底片，记不记得底片上人物的头发都是白的发亮，这种就是灰度值255哦；还有做电泳凝胶的小伙伴，得到的凝胶图就不需要反相了，可以直接进行灰度值分析哦）。我们目前要想测量条带的灰度值，就只需把那发光发亮的地方圈出来，读取灰度值就可以了，而这一部分就交给photoshop来计算吧。
在这里小石头想敲敲黑板，提醒大