沙门菌质粒毒力基因spv对DCs自噬、凋亡和免疫调节功能的影响.pdf

苏州大学
博士学位论文
沙门菌质粒毒力基因spv对DCs自噬、凋亡和免疫调节功能的影
响
姓名:李嫄渊
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:黄瑞
20100301
沙门菌质粒毒力基因 spv 对 DCs 自噬、凋亡和免疫调节功能的影响中文摘要
沙门菌质粒毒力基因 spv
对 DCs 自噬、凋亡和免疫调节功能的影响

中文提要

目的:通过细胞模型和实验动物模型,研究沙门菌毒力基因(Salmonella plasmid
virulence genes,spv)对树突状细胞(dendritic cells,DCs)自噬、凋亡和免疫调节
功能的影响及其分子机制,探索通过调控细胞自噬和凋亡水平增强机体免疫功能以
控制感染进程的新途径,并为后续新药靶位的发现提供理论和实验依据。
方法:
1. 细胞模型的体外实验。以携带 spv 基因的伤寒沙门菌(Salmonella typhi,ST)
ST8 为研究对象,用含 spv 基因的鼠伤寒沙门菌标准毒株 SR-11 作为阳性对照、不
携带 spv 基因的伤寒沙门菌 ST10 作为阴性对照,将细菌与小鼠骨髓来源的 DCs
(bone marrow-derived DCs,BMDCs)共培养;同时用不加细菌的正常细胞作对照
组;另设自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)干预组,即将细胞预先用含
RAPA 的培养基过夜处理后分别与上述三种细菌共培养。分别于不同时间段收获细
胞,用 Western blot 法检测 BMDCs 自噬蛋白 Beclin-1 的表达,比色法测定其
Caspase-3 的活性,流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析 BMDCs 的凋亡率、
吞噬能力以及表面共刺激分子 CD40、CD80 和 CD86 的表达,混合淋巴细胞反应
(mixed lymphocyte reaction,MLR)检测 BMDCs 刺激 CD4+和 CD8+初始型 T(naive
T)细胞增殖的能力,ELISA 法测定培养液上清中 IL-12、IFN-γ、IL-10 和 IL-4 等
细胞因子的水平,台盼蓝染色法进行活细胞计数,平板菌落计数法检测 BMDCs 内
活菌数。
2. 小鼠模型的体内实验。由于伤寒沙门菌是一种严格只对人类致病的病原体,
没有合适的动物模型和有效的遗传学工具,本实验利用与其有非常近缘关系的鼠伤
寒沙门菌建立动物感染模型,用鼠伤寒沙门菌标准毒株 SR-11 和不携带 spv 基因的
低毒株 BRD509 经腹腔注射感染小鼠;同时以未感染细菌的小鼠作为正常对照组;
I
中文摘要沙门菌质粒毒力基因 spv 对 DCs 自噬、凋亡和免疫调节功能的影响
另设 RAPA 干预组,即在感染模型建立后每天经腹腔注射适量 RAPA。分别在不同
时间段观察小鼠一般状态,处死小鼠后比较肝脏和脾脏的病理变化,免疫组化法检
测肝脏和脾脏 Beclin-1 和 Caspase-3 蛋白的表达,FCM 分析脾脏 DCs 的凋亡率、
吞噬能力及表面共刺激分子 CD40、CD80 和 CD86 的表达,MLR 检测脾脏 DCs 刺
激 naive T 细胞增殖的能力,ELISA 法测定血清中 IL-12、IFN-γ、IL-10 和 IL-4 等
细胞因子的水平,平板菌落计数法检测小鼠肝脏和脾脏的活菌数。
结果:
1. 用 RAPA 干预前,细菌与 BMDCs 共作用后 2 h,ST10 组的 Beclin-1 表达量
高于 SR-11 组和 ST8 组,RAPA 干预后 0 h 即可出现此差异;体内实验显示细菌感
染早期,BRD509 组小鼠脏器的 Beclin-1 表达高于 SR-11 组。用 RAPA 干预后体内
外各组 Beclin-1 的表达均升高。
2. 用 RAPA 干预前,体内外各组 DCs 的凋亡率和 Caspase-3 活性均随感染时
间的延长逐渐升高。体外实验 SR-11 组和 ST8 组高于 ST10 组,用 RAPA 干预后,
SR-11 组和 ST8 组下降,而 ST10 组上升;体内小鼠脾脏 DCs 的凋亡率和 Caspase-3
活性表现为 SR-11 组高于 BRD509 组,用药后 SR-11 组降低,而 BRD509 组升高。
3. 用 RAPA 干预前,随感染时间的延长,体内外实验各组 DCs 的吞噬能力均
不断下降。体外实验 ST10 组的吞噬率低于 SR-11 组和 ST8 组;体内实验 BRD509
组的吞噬率低于 SR-11 组。用 RAPA 干预后,体内外各组 D