sod活性测定 (2).doc

实验材料与方法
1主要试剂的配制
1．(PBS，)：
A母液：: 取Na2HPO4·12H2O（）；B母液：
1主要试剂的配制
1．(PBS，)：
A母液：: 取Na2HPO4·12H2O（）；B母液：：取NaH2PO4·2H2O（）。分别用蒸馏水定容到1000ml。
PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。
2．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：。
3．750µmol/L氮蓝四唑溶液：，避光保存。
4．100µmol/LEDTA-Na2溶液： EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。
5．20 µmol/L核黄素溶液：，避光保存。
6. K2Cr2O7溶液的配制：M（K2Cr2O7）×所要配制的浓度/2M（Cr）
7. 5%双氧水溶液：取30%的双氧水溶液25mL于200mL量筒中，加蒸馏水至150mL。现用现配。
8. NaHS溶液的配制：，少量水溶解并使用容量瓶定容到 100ml，定容后的溶液即为10mmol/L的H2S母液，在每次实验前现用现配，并使用蒸馏水稀释成实验所需的浓度。
2 生理指标的测定
(1)酶活性测定的方法和原理
方法：本实验采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法
原理：：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。
（2）酶液的提取
，放入预冷的研钵中，先加2mlPBS缓冲液（，50mmol/L）研磨匀浆后，在加入3ml PBS混匀。-2ml于4000r/min离心10min。取上清液，即为粗酶液，贮于低温下备用。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。
（3）酶活性的测定
取10ml试管9支, 7支测定样品,2支作为对照。按下表加入各种溶液。各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx(33%)日光下反应20min（要各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。
表10 SOD活性测定的试剂量
试管编号