免疫组化实验步骤.docx

免疫组化操作步骤
一、实验原理与意义
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通
过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新
技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的生物素化n抗，20c-37C20分钟
PBS洗3次各2分钟
（11）滴加试剂SABC20℃-30℃20分钟
12）PBS洗4次各5分钟
（13）DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色
（14）脱水、透明、封片、镜检。
免疫组化问题解答
1、染色过强
原因解决方法
a抗体浓度过高或孵育时间过长降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜
b孵育温度过高超过37度一般在室温20-28度
cDAB显色时间过长或浓度过高显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因解决方法
a操作过程中冲洗不充分每步冲洗3次每次5分钟
b组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2i寸闭孵育时间延长
c组织中含内原性生物素正常非免疫动物血清再封闭
d血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
原因解决方法
a抗体浓度过低、孵育时间过短提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟
4度 30-40 分钟 PBS 洗三次，每次一分钟
b试剂超过有效使用时间应更换试剂
c操作中添加试剂时缓冲液未沥干每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液
使试剂稀释（应防止切片干燥）
d室温太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4度冰箱过夜
e蛋白封闭过度封闭不要超过12分钟
4、染色阴性
原因解决方法
a操作步骤错误应重试设阳性对照
b组织中无抗原设阳性对照以验证试验结果
c一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗二抗种属无误
三步法（SP系列），实验步骤使用说明：
SP9001（兔）适用于兔来源的一抗
SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗
SP9003（山羊）适用于山羊来源的一抗
SP9000（通用型）适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗
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试剂盒规格及贮存条件
规格：3ml（50片）/6ml（120片）/18ml（360片）
贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1年
一、试剂盒内容
试剂1封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清）即用型
试剂2生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊）即用型
试剂3链酶卵白素-碱磷酶轭合物即用型
试剂3过氧化物酶标记链酶卵白素即用型
实验步骤简介：
细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，。
4度 30-40 分钟 PBS 洗三次，每次一分钟
修复：滴加复合消化液（%+%+%）（）
血清封闭：（试剂1）室温10分钟，倾去。
一抗：37℃1小时或4度过夜

相应的生物素化二抗（试剂2）37℃30-40分钟

链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3）37℃4