DNA分子标记用于中药鉴定.ppt

DNA分子标记鉴定
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分子生药学molecular pharmacognosy
在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学，所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法，是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。
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NA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性 - 退火 - 延伸三个基本反应步骤构成：
① 模板 DNA 的变性 模板 DNA 经加热至 93℃ 左右一定时间后，模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮循环作准备；
② 模板 DNA 与引物的退火 ( 复性 ) 模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；
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③ 引物的延伸 DNA 模板 - 引物结合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性 - 退火 - 延伸三过程，就可获得更多的 “ 半保留复制链 ” ，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2 ～ 4 分钟， 2 ～ 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
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2. 参加 PCR 反应的物质
主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg 2+ 。
（ 1 ）引物 是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。
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（ 2 ）酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 ( 指总反应体积为 100μl 时 ) ，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
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（ 3 ） dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系， dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris-HCl 的缓冲液将其 pH 调节到 ～ ，小量分装， -20℃ 冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。
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在 PCR 反应中， dNTP 的浓度应为 50 ～ 200μmol/L ，尤其应注意 4 种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制 ) ，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 ( 偏高或偏低 ) ，就会引起错配。浓度过低还会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 Mg 2+ 结合，使游离的 Mg 2+ 浓度降低。
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（ 4 ）模板 ( 靶基因 ) 质量 是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。
再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。
RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或酚 /SDS 法等，要防止 RNase 降解 RNA 。
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（ 5 ） Mg 2+ 浓度： Mg 2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200μmol/L 时， Mg 2+ 浓度为 ～ 为宜。
Mg 2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。
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四、生药鉴定常用的DNA分子标记方法
DNA分子标记技术
⒈以传统的southern杂交为基础的分子标记技术
RFLP限制性内切酶片段长度多态性
⒉以PCR为基础的分子标记技术
⑴RAPD 随机扩增多态性DNA
⑵SCAR 测序的扩增区段
⑶STS 测序的标记位点
⑷DAF DNA扩增产物指纹分析
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⒊以PCR和RFLP相结合的分子标记技术：AFLP 扩增的限制性内切酶片段长度多态性
⒋以重复序列为基础的分子标记技术
⑴Satellite:卫星DNA(重复单位为几百～几千碱基对)
⑵Microsatellite:微卫星DNA(重复单位为2～5碱基对)
⑶SSR：短重复序列
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（一）限制性片段长度多态（ restriction fra