实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定.doc

实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
实验四 肝组织中核酸的提取与鉴定
【目的】
验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。
【原理】 实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
实验四 肝组织中核酸的提取与鉴定
【目的】
验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。
【原理】
动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白,先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质,再用1、7mol/L NaCl溶液提取出核酸的钠盐,然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。
RNA与DNA均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖(RNA为核糖,DNA为脱氧核糖)。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。
1、磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸,磷钼酸中的钼在有还原剂(硫酸亚铁)存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。
2、嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。
3、戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛,后者能与3,5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。
脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛,它与二苯胺作用生成蓝色化合物。
【器材】
剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。
【试剂
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
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实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
1、生理盐水。
2、 0、12 mol/L三氯醋酸溶液。
3、 95% 乙醇。
4、 10% NaCl溶液
NaCl 10g溶于蒸馏水中,加至100ml。
5、 0、92 mol/L H2SO4
取浓H2SO4(比重1、84,含量98%)5ml加入蒸馏水中,加水至100ml 。
6、 钼酸铵试剂
钼酸铵3g,溶于70ml蒸馏水中,逐渐加入浓 H2SO4 14ml ,冷却后再加至100ml,混匀备用。
7、 硫酸亚铁试剂
硫酸亚铁10、6g,硫脲5g,加蒸馏水溶解并加水至500ml,冰箱内保存备用。
8、 浓氨水。
9、 0、29mol/L AgNO3
取AgNO3 5g加蒸馏水溶解并稀释至100ml,于棕色瓶避光保存。
10、 3,5二羟甲苯试剂
取浓盐酸100ml,加入FeCl3·6H2O 100mg 及二羟甲苯100mg混匀溶解后,置于棕色瓶中。临用前配制,冰箱保存。(市售3,5二羟甲苯不能直接使用,必须用苯重结晶1～2次,并用活性碳脱色后方可使用)。
11、二苯胺试剂
取1g纯的二苯胺溶于100ml冰乙酸中,加入2、75ml浓硫酸,盛于棕色瓶中,临用前配制。
【操作】
1、核酸的提取与分离:
(1)将新鲜猪肝剪碎置于匀浆器中,加入等量的生理盐水,制成匀浆。
(2)将5ml肝匀浆置于离心管内,立即加入0、12mol/L三氯醋酸5ml,用玻棒搅匀,静置8分钟后离心。
(3)倾去上清液,加95% 乙醇5ml