SantaCruz免疫沉淀流程.doc

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免疫沉淀
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培养细胞（100 毫米细胞培养皿上达到80-90% 汇合度，或者细胞培养瓶中达到大约 2-5 x 107 个悬浮细胞）。
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单层细胞培养瓶中加 3 ml 冰冷 RIPA 缓冲液，4º C 孵育2:
免疫沉淀
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培养细胞（100 毫米细胞培养皿上达到80-90% 汇合度，或者细胞培养瓶中达到大约 2-5 x 107 个悬浮细胞）。
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单层细胞培养瓶中加 3 ml 冰冷 RIPA 缓冲液，4º C 孵育 10 分钟。如果是悬浮细胞，RIPA 缓冲液加到盛有漂洗过的细胞沉淀中。
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破碎细胞用反复通过 21 号针头。然后移至15ml离心管。
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可用 1 ml 冰冷缓冲液清洗细胞培养瓶，并入第一次裂解液。
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4º C 下 10,000xg 离心 10 分钟沉淀细胞碎片。将上清液移至一个新的15ml离心管并置于冰上。
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加入 µg 相应对照 IgG（与一抗的来源种属相一致），同时加入 20 µl 重悬浮的琼脂糖结合蛋白（蛋白A－琼脂糖，蛋白G－琼脂糖，蛋白A/G－琼脂糖，蛋白L－琼脂糖）预吸附细胞裂解液。4º C 孵育 30 分钟。
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4º C 下，2,500 rpm（ 例如：Eppendorf 5415D；约1,000xg）离心 5min。
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将1ml上清液或约 100–500 µg 。加入 1–10 µl（–2 µg）一抗（ 最佳的抗体浓度应通过滴定获得）并在 4º C 下孵育 1小时。替代方法：也可用琼脂糖偶联的抗体，加 20 µl（相当于5微升球珠）4º C 温育 1 小时至过夜，同时平缓摇动；跳过下一步操作。
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加入20ul 的琼脂糖偶联悬浮液（Protein A-Agarose