传染病-实习报告.doc

１
实习报告
学 院:
动物医学院
课 程:
兽医传染病学实习
小牛血清和NAD。然后将平板边沿用酒精灯外焰灼烧消毒，将TSA溶液倒入平板中，均匀铺满整个平板，待其冷却凝固后，标记好班级，组名和时间等备用。
日期： 星期：星期二
细菌学检查和病毒学检查病料取样。
1． 细菌的别离培养：
取病猪肺脏〔冰冻组织需充分解冻〕，用酒精棉球点燃消毒肺脏外表，无菌手术刀切口，将接种环伸入于肺脏肺泡内，无菌划线接种TSA平板。具体操作如下：
３
右手执笔式持接种环，在酒精灯火焰上灼烧接种环，待冷；
左手抓紧琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种。或者，将平皿盖放在试验台上，尽量直立平皿靠近酒精灯火焰；
右手接种环在琼脂的一端涂布，划线时，接种环与琼脂外表是30°-40°的角度轻轻接触，利用腕力动作，切忌划破琼脂外表；
接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明接种时间，接种者等，然后将平皿的底朝上，放置在37°温箱内培养24-48小时〔培养后可出现多种菌落，注意区分不同培养时间点不同类型菌类形态〕。
2．组织触片和染色观察：
触片：取一小块肺脏组织，在洁净的载玻片上轻轻地作2～3 个压迹，制成触片；
枯燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形；
固定：在酒精灯处快速的来回通过2-3秒钟，并不时以载玻片反面接触皮肤，不觉过烫为宜〔不超过60℃〕，放置待冷后，进行染色；
初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min；
水洗：用洗瓶中自来水冲洗，直至洗下的水呈无色为止；
媒染：用100-1000μL移液枪吸取约300μL碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min；
水洗：用洗瓶中自来水冲洗，直至洗下的水呈无色为止；
脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗；
复染：滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖触片约1min；
水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止；
枯燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。
3．病毒学病料处理
a) 临床上各种疾病的病症非常相似，而且极易发生混合感染，因此确诊需 依赖于实验室的诊断。病毒性疾病的实验室检验的大致程序如下：临床标本→别离培养→初步鉴定→最后鉴定。
b) 用剪刀剪取病变明显的肺脏部位，置于小青瓶或平皿中，用小剪刀剪成大小约1mm3的碎块，然后参加等量灭菌生理盐水或PBS，置于玻璃匀浆器中进行匀浆，组织匀浆液倒入小青瓶中，置于-20℃冰箱冻存备用。
c) 老师帮助我们反复冻融三次。
日期： 星期：星期三 白天
〔一〕细菌的镜检和增殖培养
温箱培养24h，挑取疑似菌落〔HPS为无色或淡灰色，半透明小菌落〕，制备细菌涂片，革兰氏染色，镜检，将疑似菌落进行再次划板纯化。〔镜检：革兰氏染色阴性，两极着色，杆菌〕挑取单个纯培养的菌落，用接种环接种到TBS液体培养基中，37℃，振摇培养16-32h。
４
病毒细胞接种
1显微镜观察母细胞的生长状态：在显微镜下观察母细胞的生长密度和生长状况。
细胞接种：在细胞板中参加过滤后的组织上清液，使其铺满细胞外表，置于37℃二氧化碳培养箱孵育1h；弃去组织滤液，在细胞中参加细胞维持液，37℃二氧化碳培养箱培养，每天观察细胞生长情况和有无病变。
RNA的提取
取100ul别离病毒液，参加1mlTrizol试剂，匀浆，室温静置2-3min；
参加200ul氯仿，剧烈震荡，室温静置2-3min；4℃12000rpm离心15min；
取上清，参加等体积的异丙醇，室温静置10min；4℃12000rpm离心10min；
弃上清，%乙醇，振摇，4℃12000rpm离心5min；
弃上清，枯燥沉淀物〔室温约5min〕；参加20ulDEPC水溶解沉淀。
〔四〕RT-PCR〔鉴别高致病性和非高致病性毒株〕
上游引物：5'-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3'
下游引物：5'-ATRATGGCTTGAGCT