体外转录试剂盒说明书.doc

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体外转录试剂盒说明书
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实用标准文案
使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上
转录反应步骤和孵育
拟物为4:1时提供了一个很好的
RNA产量和加帽效
率的平衡。没有加帽的转录在爪蟾卵母细胞的显微注射实验中不会出现问题。
这些未加帽的
转录很可能迅速的被卵母细胞降解
。
除了加入不同比率的
m7G(5')ppp(5')G
，T7-mMESSAGEmMACHINE
反应在标准条件下
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进行。使用1ug
的T7球蛋白模板
DNA37度孵育1h。球蛋白RNA(6
μg/mL)25ul在的
ReticLysateIVT
?进行翻译，
μCiof[35S]
(1200蛋氨酸Ci/mmol)
，30°C反应60
min。测量TCA-可沉淀cpm
的量。
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精彩文档
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实用标准文案
彻底混匀
轻弹离心管或用移液器上下轻轻吹打混匀混合物，短暂低速离心，收集管底的反应混合物。
37度孵育1hr
一般来说，孵育1h后可获得80％合成。对于最大化合成，建议孵育2h。由于SP6反应稍
微慢于T3和T7反应，它们尤其可能受益于第2h的孵育。
对于合成《300base的转录和转录效率低下的模板，建议第二个小时的孵育。
如果反应是示踪标记：孵育后（TURBODNase处理前或处理后），通过TCA共沉淀可等
分的放射性标记示踪反应来评价产量(seestep5.,“Quantitationbytrace
radiolabeling”onpage14)
，37℃孵育15min。
DNase处理可清除模板DNA，对一些应用来说并不必要，因为相对于RNA来说，模板
DNA的浓度非常低。
,混匀
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℃孵育15min
RNA的回收
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实用标准文案
转录反应后所需要的净化程度取决于RNA的用途。以下是四种不同的方法，根据你的用途
选择一种或多种。
?Kit
此试剂盒专为体外转录合成高产量的RNA的纯化所设计。快速、简单的去除RNA中的核
苷酸、短的寡核苷酸、蛋白。回收的RNA可用于任何需要高纯度RNA的实验。
氯化锂沉淀
氯化锂沉淀法是一种简单有效的可除去未合成的核苷酸和大部分蛋白质。但它并不沉淀转移
的RNA，也不沉淀小于300核苷酸的RNA。同时，为了保证沉淀效率，RNA的浓度至少
。mMACHINE?反应获得的RNA产量相对较低，下面第一
步加LiCL沉淀液之前不用水稀释转录产物
-free水、30ulLiCL沉淀液，终止反应，沉淀RNA。
，-20℃冷却30min。
℃最大速度离心