体外转录试剂盒说明书.docx

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使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰
上
转录反应步骤和孵育
1 .解冻冷冻的试剂
把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在・20。
vortexIO xreaction buffer和2 xNTP/CAP至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把
2 xNTP/CAP 放在冰上、10 xreaction buffer 保存在室温，
所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。
3 .室温下转录反应
如果反应在冰上进行,10 xreaction buffer中的亚精胺可以与模板中的DNA共沉淀， 离心管中加入水和核甘酸后再加入10 xreaction buffer °
以下是一个20ul的反应体系，可按需要放大或缩小。
当RNA长度为300base-5kb时采用以下反应体系
对于更长或更短的转录'参考20页的“ Optimizing yield of long transcripts…和
“ Optimizing yield of short transcripts ” 部分 °
当合成转录的长度大于5或6KB时，限制GTP生成率，会导致产量降低、过早终止转录。
为了避免这种情况，可能需要补充额外的GTP支持反应。下面是添加特定体积的GTP对普 通转录反应的影响。
对于T7和T3试剂盒，提供的GTP为30mM。对于SP6，为20mM.）应该添加多少额 外的GTP?
，我们建议最初测试加入13的GTP，对于更长的模板应该试试滴定额外 的GTP确定所需的最小值。添加GTP将减少转录合成加帽的比例，但将引起产量升高。
加帽转录的比例与反应中GTP中CAP的模拟物的比率成正比。
RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡 在网织红细胞溶解物中，我们测试了 GTP不同比例的 CAP模拟物对转录反应的RNA产量
和产生RNA的翻译效率的影响。(表1)
网织红细胞球蛋白的RNA的翻译依赖于CAP。随着GTP的CAP模拟物增加，RNA的产量 减少。相反，合成的RNA的翻译效率随着模拟物的比率增加而增加，这反映了 5 '端力口帽的转 录的增加。注意GTP的CAP模拟物为4:1时提供了一个很好的RNA产量和加帽效率的平 衡。没有加帽的转录在爪蟾卵母细胞的显微注射实验中不会出现问题。这些未加帽的转录很 可能迅速的被卵母细胞降解。
除了加入不同比率的m7G(5)ppp(5)G ，T7-mMESSAGE mMACHINE 反应在标准条件下
进行。使用1ug的T7球蛋白模板DNA 37度孵育1h。球蛋白RNA (6 |1 g/mL) 2在5ul的Retie Lysate IVT ?进行翻译，加入 (.1 Ci of [35S] (1 蛋 20 氨 0 酸 Ci/mmol)，30 C 反
应60
min。测量TCA-可沉淀cpm的量。
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