实验一 微生物细胞数的计数.doc

环境工程微生物学实验实验一微生物细胞数的计数一、目的了解血球计数板的结构,掌握使用和计算方法。二、仪器和材料1、器材:显微镜、擦镜纸、吸水纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯。2、测试样品:酵母菌液(细菌悬液也可)三、血球计数板的结构与计算方法血球计数板(图1)是一块比普通载玻片厚的特制玻片制成。玻片中央刻有四条槽,中央两条槽之间的平面比其他平面略低,中央有一小槽,槽的两边的平面上各刻有9个大方格。中间的一个大方格为计数室,它的长和宽各为1mm,,。计数室有两种规格:一种是把大方格分成16中格,每一中格分成25小格,共400小格;另一种规格是把一大方格分成25中格,每一中格分成16小格,总共也是400小格。计算方法如下:图1血球计数板的结构图(A—正面图;B—侧面图)1、16×25的计数板计算公式细胞数/mL=(100小格内的细胞数/100)×400×10000×稀释倍数2、25×16的计数板计算公式细胞数/mL=(80小格内的细胞数/80)×400×10000×稀释倍数四、操作步骤1、稀释样品,为了便于计数,将样品适当稀释,使每格约含5个细胞。2、取干净的血球计数板,用厚盖玻片盖住中央的计数室,用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖玻片的边缘,菌液则自行渗入计数室,静置5~10min即可计数。3、将血球计数板置于载物台上,用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动细调节器,以便看到计数室内不同浓度的菌体。现以16×25规格的计数板为例,数四个角(左上、右上、左下、右下)的四中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25×16规格的计数板,除取四个角上四中格外,还取正中的一个中格(即80小格),对位于大格线上的酵母菌只计大格的上方及左方线上的酵母菌,或只计下方及右方线上的酵母菌。每个样品重复计数3次,取平均值,再按公式计算每毫升菌液中所含的菌数。4、测数完毕,取下盖玻片,用清水把血球计数板冲洗干净,用吸水纸轻轻吸去计数室内的水分,再用擦镜纸小心地吸干计数板(注意勿使网格受到磨损),然后放入盒内保存。五、实验报告计算并报告所测样品每毫升(克)的含菌数。实验二培养基的制备和灭菌一、目的1、熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。2、掌握培养基和无菌水的制备方法。3、掌握高压蒸气灭菌技术。二、仪器和材料1、药品:牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂或市售营养琼脂培养基、蒸馏水、10%HCI、10%NaOH2、器材:培养皿(直径90mm)10套,试管(15mm×150mm)5支,(18mm×180mm)5支,移液管(10mL)1支,(1mL)2支,锥形瓶(250mL)2个;烧杯(300mL)1个,玻璃珠30粒、纱布、棉花、牛皮纸(或报纸)、~、高压蒸气灭菌锅、烘箱、酒精灯。三、实验内容1、玻璃器皿的洗涤和包装(1)洗涤玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡,再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。(2)包装①移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成1~(以防细菌吸入口中,并避免将口中细菌吹入管内)。棉塞要塞得松紧适宜,吸时既能通气,又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的移液管的尖端,放在4~5cm宽的长纸条的一端,移液管与纸条约成30o夹角,折叠包装纸包住移液管的尖端,用左手将移液管压紧,在桌面上向前搓转,纸条螺旋式地包在移液管外面,余下纸头折叠打结。按实验需要,可单支包装或多支包装,待灭菌。②用棉花将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住棉塞的制作:按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量,将棉花铺成中心厚,周围逐渐变薄的圆形,对折后卷成卷,一手握粗端,将细端塞入试管或锥形瓶的口内,棉塞不宜过松或过紧,用手提棉塞,以管、瓶不掉下为准。棉塞四周应紧贴管壁和瓶壁,不能有皱褶,以防空气中微生物沿棉塞皱褶侵入。棉塞插入2/3,其余留在管口(或瓶口)外,便于拔塞。试管、锥形瓶塞好棉塞后,用牛皮纸包并用细绳或橡皮筋捆扎好放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。③培养皿由一底一盖组成一套,用牛皮纸或报纸将10套培养皿(皿底朝里,皿盖朝外,5套、5套相对)包好。2、培养基的制备培养基是微生物的繁殖基地。通常根据微生物生长繁殖所需要的各种营养物配制而成。其中含水分、碳化合物、氮化合物、无机盐等,这些营养物可提供微生物碳源、能源、氮源等,组成细胞及调节代谢活动。按培养目的不同,或培养不同种类微生物可配成各种培养基。通常培养细菌是用肉膏蛋白胨培养基,培养放线菌常用淀粉培养基,用豆芽汁培养霉菌,用麦芽汁培养酵母菌。培养微生物除了满足它们各自营养要求外,还要给予适宜的pH、渗透压和温度等。根据研究目的的不同,可配制成固体、半固体和