实验六脲酶Km值的测定.doc

实验六 脲酶Km值的测定
一、目的：
掌握测定米氏常数K值的原理和方法
二、原理：
酶促动力学研究酶促反应的速度以及各种因素，如底物浓度、酶浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等的改变对酶促反应速度的影响。在其他条件不变的情况下，酶促实验六 脲酶Km值的测定
一、目的：
掌握测定米氏常数K值的原理和方法
二、原理：
酶促动力学研究酶促反应的速度以及各种因素，如底物浓度、酶浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等的改变对酶促反应速度的影响。在其他条件不变的情况下，酶促反应速度与
Vmax[s]
Km+ [s]
V=
底物浓度的关系可用下式表示： ，这就是米氏方程。
式中Vmax 表示在给定的条件下的最大反应组毒，Km 即米式常数，为达到最大反应速度一半
1
V
时的底物浓度，是酶的特征常数，常用测定米式常数的方法是双倒数作图法，即以 为纵
1
Vmax
1
[s]
坐标， 为横坐标，作图得出一条直线，直线在纵轴上的截距为 ,在横轴上的截距
1
Km
为: — 。
本实验是测定脲酶的Ｋｍ值，选择不同的脲酶浓度，使其在脲酶作用下水解，用单位时间内产物（NH4）2CO3的生成量来表示这个酶促反应的速度。（NH4）2CO3的生成量可利用其在碱性溶液中与奈氏试剂生成橙黄色的碘化双汞铵的反应，在一定范围内呈色深浅与（NH4）2CO3的量成正比，可在460nm波长处用比色法测得与产物（NH4）2CO3相对应的吸光度，然后用已知浓度的（NH4）2CO3溶液与奈氏试剂反应，得一标准曲线，查对标准曲线就可知道产物（NH4）2CO3的生成量，再计算出单位时间内的产物（NH
4）2CO3生成量，求得脲酶催化的反应速度。
三、实验材料、仪器设备及试剂
（一）、材料
大豆粉
（二）、仪器设备
721型分光光度计、恒温水浴、离心机、试管、漏斗、移液管等。
（三）、试剂
1、不同浓度脲液：提取分析纯脲，加无离子水溶解，定容至1000ml，即为1/10mol/L的脲液，进一步稀释成1/20mol/L,1/30mol/L,1/40mol/L等不同浓度脲液。
2、1/15mol/L ：取1/15mol/L Na2HPO4溶液60ml和1/15mol/LKH2PO4溶液40ml，混匀即可。
3、10%ZnSO4
5、10%酒石酸钾钠
6、奈氏试剂：称取5gKI，溶于5ml无离子水中，加入饱和HgCl2溶液（100
Ml水约溶解 Hgcl2），并不断搅拌，直至产生的朱红色沉淀不再溶解时，再加4ml50%的NaOH溶液，稀释至100ml，混匀，静置过夜，倾出上清液贮存于棕色瓶中。
7、(NH4)2SO4标准液
8、30%乙醇
四、操作步骤
（一）、脲酶的提取
称取4g大豆粉，加100ml30%乙醇，充分摇匀后置于冰箱中过夜，次日用2000转/分离心3分钟，取上清液备用。
（二）、测定
（１）、取试管５支编号，按下表加入试剂和操作
试剂及操作
管号
１
２
３
４
５
脲液浓度（m