酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算.doc

酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算〔以日立U3010为例〕
强玮 2014-3-31
Km
根据酶促反应方程，即米-曼式氏方程〔Michaelis-Menten equation〕：
V =(VmaxS)/(Km + S)
点击“Fit”进行拟合，Km、Vmax值等拟合的数据就在弹出的窗口中显示出来了，注意这里的Vmax值不是本文所指的Vmax值，两者的意义和单位都不一样，发表用的Vmax单位通常为nkat×mg-1 protein〔见下文〕，而此处的Vmax为输入数据时的Y轴值，如果数据由日立U3010分光光度计测得，则其代表“活度”，即每分钟内吸光度变化的量。
Xn
Hill函数： Y=Vmax
Kn+ Xn
Vmax
Vmax表示在一定酶量下的最大反应速率，即酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓
度呈正比。通常发表论文的Vmax单位为nkat×mg-1 protein，表示每毫克纯化的蛋白有多少个nkat活力。这里有必要弄清楚酶活力单位的意义，国际上有两种活力单位：IU和Kat，它们的意义分别为：
1IU：指在特定条件〔25℃，其它为最适条件〕下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
1Kat：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。
Kat和IU的换算关系：1 Kat=6×107IU， 1IU= Kat
日立U3010测得的酶活力是用“活度”表示的，即每分钟内吸光度变化的量。所以要将活度换算为Kat，首先必须将吸光度的变化与底物的变化联系起来。这里的底物是指具有特定波长的光吸收，用来指示酶反应进程的物种，如氧化复原酶通常选择NADH/NADPH。这里以托品酮复原酶TRI为例，测定340nm处NADPH的活度值。首先吸光度Abs与底物浓度c是有公式联系的：
Abs=c·ε·l
在实际测定中，“ε·l”部分可以作为一个常数处理，在一个反应体系中将NADPH的浓度固定，测出吸光度A值后即可换算出“ε·l”值，通常选3个浓度，取三个“ε·l”的品均值。如TRI的酶活测定中：
200 uM·ε·l2 → ε·l
100 uM·ε·l → ε·l 平均ε·l
由于活度的意义是1min内吸光度的变化量，则选取一个线性比较好的酶反应的动态吸光度曲线，记录下它0s和60s两个点的吸光度值，用上面得到的ε·l值算出各自的底物浓度，其差值对应的就是该活度下的底物变化量。
如一反应:
0s Abs → c(NADPH)= uM
60s Abs= → c(NADPH)= uM
由于反应体系是1ml,则变化量为△-=17 nM/min对应17 nM nM的NADPH发生了转化。为便于计算，换算为：
活度/min = nM/min (NADPH)
这样，吸光度的变化与底物的变化联系起来就联系起来了，用酶活力单位IU的定义来换算，很容易就得出：