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→拼接→导入→表达人类需要的基因产物由于基因工程是在 DNA 分子水平上进行操作, 因此又叫做重组 DNA 技术。二. 基因工程的基本工具(一)“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(简称限制酶) 1 .来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。 2 .功能:能够识别双链 DNA 分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 3 .结果:经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式: 黏性末端和平末端。(二)“分子针线”—— DNA 连接酶 1 .分类: 根据酶的来源不同,可分为 E· coliDNA 连接酶和 T 4 DNA 连接酶两类 2 .功能: 恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。★两种 DNA 连接酶(E· coliDNA 连接酶和 T 4 DNA 连接酶) 的比较: ①相同点: 都缝合磷酸二酯键②区别: IiDNA 连接酶来源于大肠杆菌,只能使黏性末端之间连接; T 4 DNA 连接酶能缝合两种末端,但连接平末端之间的效率较低。★ DNA 连接酶与 DNA 聚合酶作用的比较 DNA 连接酶 DNA 聚合酶不同点连接的 DNA 双链单链模板不要模板要模板连接的对象 2个 DNA 片段单个脱氧核苷酸加到已存在的单链 DNA 片段上相同点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质(三)“分子运输车”——载体 1. 载体具备的条件: ①能在受体细胞中复制并稳定保存; ②具有一至多个限制酶切割位点,供外源 DNA 片段插入; ③具有标记基因,供重组 DNA 的鉴定和选择。 2. 基因工程常用的载体有: 质粒、噬菌体和动、植物病毒等。最早应用的载体是质粒,它是细菌细胞中的一种很小的双链环状 DNA 分子。 (一) 获得目的基因(目的基因的获取) 1. 获取方法主要有两种: ①从自然界中已有的物种中分离出来,如可从基因文库中获取。②用人工的方法合成。★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离,获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。 2. 利用 PCR 技术扩增目的基因(1) PCR 的含义:是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。(2 )目的:获取大量的目的基因(3 )原理: DNA 双链复制(4 )过程:第一步:加热至 90~ 95℃ DNA 解链为单链; 第二步:冷却到 55~ 60℃, 引物与两条单链 DNA 结合; 第三步:加热至 70~ 75℃, 热稳定 DNA 聚合酶从引物起始进行互补链的合成。(5 )特点:指数形式扩增(二) 制备重组 DNA 分子( 基因表达载体的构建) 1 .重组 DNA 分子的组成: 除了目的基因外,还必须有标记基因。★标记基因的作用:鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 2 .方法: 同种限制酶分别切割载体和目的基因,再用 DNA 连接酶把两者连接。(三) 转化受体细胞(将目的基因导入受体细胞) 1. 转化的概念: 是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2. 常用的转化方法: ①将目的基因导入植物细胞: 采用最多的方法是农杆菌介导转化技术( 农杆菌转化法), 其次还有基因枪介导转化技术( 基因枪法)和花粉管通道技术( 花粉管通道法)。②将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。③将目的基因导入微生物细胞: Ca + 处理法。(四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达(目的基因的检测与鉴定) 1. 首先要检测转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因,方法是采用 DNA 分子杂交技术。 2. 其次还要检测目的基因是否转录出 mRNA ,方法是采用 DNA 分子杂交技术。 3. 最后检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法是采用抗原—抗体杂交技术。 4. 有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。第二节基因工程的应用 1 .运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是:能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。 2 .基因工程的应用(1 )植物基因工程:抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。(2 )动物基因工程:提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质,用转基因动物生产药物, 用转基因动物作器官移植的供体等。(3 )基因诊断和基因治疗: 生物苏教版选修三学案郭高宾整