PI染色.doc

PI染色
荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞PI染色
荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。
PI可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色
钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein-AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM
基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490nm,发射：515nm）。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细
胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺
旋从而产生红色荧光（激发：535nm,发射：617nm）。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm
激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别
确定PI和Calcein-AM的合适浓度。
•试剂
Calcein-AM
PI
.用荧光显微镜观察细胞形态
以HeLa细胞染色为例，请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。
1•染色溶液的配制
1）用1ml无水DMSO溶解1mgCalcein-AM，制备成1mmol/l的Calcein-AM储备液，-20C下密闭冷冻保存。
2）用1mlddH2O溶解1mgPI，（1mgPI/1mlH2O），-20C下密闭冷冻保存。
3）将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。
4）加10卩lCalcein-AM储备液和15卩lPI储备液至5mlPBS中配制成染色溶液。
Calcein-AM的终浓度为2卩mol/1，PI的终浓度为4卩mol/1。
•细胞染色
1）染色HeLa细胞等贴壁细胞时，先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。
2）将细胞悬液离心3分钟（1,000rpm）。
3）去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至105-106个/ml。再用移液器充分混匀。
4）由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM
遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。
5）将200卩l细胞悬液移至小试管中，加入100卩l染色溶液，在37C下孵育15分钟。
6）在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。
7）在荧光显微镜下，先使用490土10n