酶联免疫吸附试验.ppt

酶联免疫吸附试验 Enzymes linked immunosorbent assay 简介 1971 年,瑞典学者 Engvail 和 Perlmann 、荷兰学者 Van Schuurs 分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,称为酶联免疫吸附试验。 ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。该技术应用非常广泛,几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测。酶和抗体或抗原结合后,既不改变抗体与抗原免疫学反应的特异性,也不影响酶本身的酶学活性,即在相应而合适的作用底物参与下,使基质水解而呈色,或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观察,也可用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在,从而证明发生了相应的免疫反应。所以,这是一种特异而敏感的技术,可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位, 或在微克,甚至纳米水平上对其进行定量。基本原理?先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上, 并保持其免疫活性。?测定时,将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。?用洗涤的方法洗去多余的分离抗原-抗体复合物和游离成分。?然后加入酶的作用底物催化显色,进行定性或定量测定。 1,固相载体固相载体在 ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器,不参与化学反应。可作 ELISA 中载体的材料很多,最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性,加之它的价格低廉,所以被普遍采用。 ELISA 载体的形状主要有三种:微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用,专用于 EILSA 的产品称为 ELISA 板,国际上标准的微量滴定板为 8× 12 的 96 孔式。聚苯乙烯 ELISA 板由于原料的不同和制作工艺的差别,各种产品的质量差异很大, 因此,每一批号的 ELISA 板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法为: 以一定浓度的人 IgG (一般为 10ng/ml ) 包被 ELISA 板各孔,洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人 IgG 抗体,保温后洗涤,加底物显色,终止酶反应后,分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件,使各孔读数在吸光度 左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差,应小于 10% 。 2,包被抗原或抗体固定到固相载体过程称为包被(coating) 。抗原或抗体蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的, 大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。 IgG 对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力,其联结多发生在 Fc段上,抗体结合点暴露于外, 因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时,抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露,在这种情况下,直接包被效果不佳,可以采用间接的捕获包被法,即先将针对该抗原的特异抗体作预包被,其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面,其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法,试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少,仅为直接包被的 1/10 乃至于/100 。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如,在检测抗 DNA 抗体时,需用 DNA 作为包被抗原,而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射(例如 30W 紫外灯, 75cm 照射 12小时),以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质,如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被,也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被,即用亲和素先包被载体,然后加入生物素化的 DNA ,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。 脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入酶联免疫试剂盒板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的 ELISA ,酶联免疫试剂盒试剂一般采用这种包被方式。 3,封闭封闭(blocking) 是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低,吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙,封闭就是让大量不相关的蛋白