高效液相色谱法 (2).ppt

高效液相色谱法
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第六节 高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳仪器
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二、高效毛细管高效液相色谱法
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第六节 高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳仪器
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二、高效毛细管电泳基本原理
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。
经典电泳分离法的不足：所用
分离柱的柱径大，柱较短，分
离效率不高（远低于HPLC），
温度影响大。
高效毛细管电泳在技术上采取
了两项重要改进。
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高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：
；
二是采用了高达数千伏的电压。
★ 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。
★ 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，
★ 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。
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电泳现象与电渗流现象
电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度v电泳
电渗流现象： 玻璃表面存在硅羟基, pH>3时, 形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度v电渗流
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分离过程：
电场作用下,柱中出现：电泳现象和电渗流现象
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和
正离子：两种效应的运动方向一致,在负极最先流出
中性粒子无电泳现象,受电渗流影响,在阳离子后流出
阴离子：两种效应的运动方向相反，v电渗流 >v电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。
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分离类型
（CZE）
最普遍、最基本的一种分离模式。
2. 毛细管凝胶电泳（CGE）
将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。
可分离测定蛋白质、DNA等。
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3. 毛细管胶束电动色谱（MECC）
在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且v电渗流 > v电泳 ，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。
可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。
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三、仪器装置
电压：0～30KV。
分离柱不涂敷任何固定液，
紫外或激光诱导荧光检测器
（可检测到：10-19～10-21 mol/L）
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四、影响柱效的因素及改进方法
热效应：焦耳热是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，选择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。
电渗流控制：电渗流的大小和方向，依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。
使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂，则可以改变电渗流的方向。
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五、主要特点和应用
高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。
高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。
高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；;4分钟可分离10种蛋白质.
试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样
仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。
不足之处：
进样不够方便。
应用范围相对较窄。
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第七节 纸层析和薄层层析法
一、纸层析和薄层层析分离过程
纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。
纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。
将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶