支原体检测PCR方法.docx

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PCR法检测支原体
实验原理：
通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过 PCR特异性扩增，会将目标 DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测， 可编辑可修改
PCR法检测支原体
实验原理：
通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过 PCR特异性扩增，会将目标 DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结
果。反之当没有支原体污染时，由于没有模板， PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保 PCR法的精确性，故需要找到最优的 PCR条件在进行检测。
实验目的：
检测培养的细胞是否有支原体污染。
实验材料：
ml EP 管； PCR管；镊子；手套；口罩； EP管架；移液枪（ 100 ul ，10 ul ）及配套枪头 ( 黄、白 ) ；dd H2O；上下游引物（两组）； dNTPs； 10 x Buffer ；Easy
Taq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（ 200ml）；量筒（ 50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统；
PCR引物：
LZY-5 Myco universal F ：GGGGAATGGGTGAGTAACACG
LZY-5 Myco universal R ：CGGATAACGCTTGCGACCTATG
产物大小： 500bp
LZY-6 mycotest F ：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCT
LZY-6 mycotest R ：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC
产物大小： 250bp
实验步骤：
1、取样：
直接取培养细胞的培养基上清。
2、PCR（为 25ul 体系）
1、配制反应体系，根据检测样本数 +1 个阴性对照（水） +1 个阳性对照，算出 PCR
样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的
量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。
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25 ul 反应体系
5#引物： LZY-5 Myco universal
反应体系
反应条件
检测培养基
1 ul
94
℃
3 min
LZY-5
-F
ul
94
℃
30 s
LZY-5
-R
ul
55℃
30 s
10xBuffer
ul
72
℃
30s
dNTP
ul
25 cycles
或 30 cycles
Easy Taq
ul
72
℃
10min
ddH2O
ul
6#引物： LZY-6 mycotest
反应体系