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PCR法支原体检测
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PCR法支原体测定PROTOCOL
关键词
PCR、支原体
修订记录
姓名
部门/职务
签名
日期（年-月-日）
混合液中分别加入1ul阴性对照样品（内毒素检查用水），1ul供试品，1ul阳性对照样品(Control Template)和2ul供试品阳性对照（1ul供试品+1ulControl Template)，添加样品时务必防止交叉污染。
为了避免交叉污染，实验过程需分区域操作。在实验区域1完成PCR反应液配置后，先在该实验区域加入1ul内毒素检查用水（阴性对照），再在实验区域2加入1ul供试品，最后在实验区域3加入1ul Control Template（阳性对照）及“1ul供试品+1ul control Template”（供试品阳性对照）。
，设定以下反应条件进行PCR反应。
94℃30sec
94℃ 30sec
55℃ 2min 35 cycles
72℃ 1min
72℃ 5min
2nd PCR反应

试剂
用量(ul)
内毒素检查用水

10× PCR Buffer
5
dNTP Mixture
4
MCGp F2 Primer

MCGp R2 Primer

TaKaRa Taq

PCR反应产物稀释100倍，。为了防止交叉污染，加样时需分区域操作，。
将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。
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94℃30sec
94℃ 30sec
55℃ 2min 30 cycles
72℃ 1min
72℃ 5min
扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析
1%琼脂糖凝胶的制备
Regular Agarose G-10，加入约40ml 1× TAE Buffer（大于40ml），置于微波炉中中高火加热2min，摇匀，再加热2min。稍微冷却后加入1ul Goldview，振荡摇匀，倒入胶槽中，冷却30min左右直至凝固。
取出制备完成的琼脂糖凝胶置于多功能水平电泳槽中，加入1× TAE Buffer直至超过凝胶2mm左右。
上样
取1st和2nd PCR产物各10ul， 10×Loading Buffer，混匀后，取10ul上样，用6ul DL5000 DNA Marker作为对照。
电泳及分析
调节电压120V，电泳1h。取出凝胶置于凝胶成像系统，拍照并分析确认扩增片段的有无及片段大小。

Control实验（阴性对照，阳性对照，供试品阳性对照）
本实验中以内毒素检查用水作为阴性对照样品；以Control Template作为阳性对照样品；以“供试品+Control Template”作为供试品阳性对照样品。使用Control Template时，F1和R1引物扩增产物是810 bp（见