高效液相色谱法2.ppt

高效液相色谱法2
GC：填充柱： H = A + B/u + Cu
毛细管柱：H = B/u + Cu
HPLC： H = A + Cu
3. 分离条件的选择
(1) HPLC中的速率理论
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体、强心苷以及糖类）等
流动相通常采用烷烃加适量极性调节剂
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b. 反相键合相色谱法的分离条件
一般以非极性键合相和固定相
最常用ODS（C18），短链烷基键合相用于极性化合物的分离，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物（如黄酮苷类）
流动相一般以极性最强的水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂
可选择弱酸（醋酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐（磷酸盐、醋酸盐）调节pH，抑制组分理解，增强保留
调节流动相的离子强度也可改善分离效果
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c. 反相离子对色谱法的分离条件
C8或C18键合相为固定相
离子对试剂的选择
酸类或带负电荷的物质，常用季铵盐
分析碱类或带正电荷的物质，常用烷基磺酸盐
离子对试剂浓度一般在3-10mmol/L
流动相pH的选择
调节pH使试样组分与离子对试剂全部离子化
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4. 分离类型选择
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三、高效液相色谱仪
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流程
动画
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1. 输液系统
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
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洗脱方式：
等强度洗脱：isocratic elution
在一个分析周期内流动相组成保持恒定。
梯度洗脱：gradient elution
在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH等。
(2)梯度淋洗装置
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高压梯度:
利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。
低压梯度:
一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
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(1) 进样器：六通进样阀
流路中为高压力工作状态，
通常使用耐高压的六通阀进样装置，
其结构如图所示：
2. 分离和进样系统
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(2) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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3. 检测系统
专属型检测器
只能检测某些组分的某一性质
紫外检测器、荧光检测器
通用型检测器
检测一般物质均具有的性质
示差折光检测器、蒸发光散射检测器
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灵敏度高
噪音低
线性范围宽
重复性好
适用范围广
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应用最广，对大部分有机化合物有响应。
特点：
灵敏度高；
线形范围高；
流通池可做的很小（容积 8μL）；
对流动相的流速和温度变化不敏感；
波长可选，易于操作；
可用于梯度洗脱。
紫外检测器 ultraviolet detector; UVD
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a. 可变波长检测器
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b. 光电二极管阵列检测器 photodiode array detector; PDAD
紫外检测器的重要进展；
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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光电二极管阵列检测器
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工作原理
化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的荧光；荧光强度（F）与激发光强度（I0）及荧光物质浓度（c）之间的关系为
Q：量子产率 K：荧光收集效率 ε:摩尔吸光系数
l：光径长度
(2) 荧光检测器 fluorophotometric detector；FD
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特点：
灵敏度高（高于紫外检测器）
只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。
是体内药物分析常用的检测器之一
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(3) 安培检测器 amperometric detector
工作原理
在电极间施加一恒定电位，当电活性组分经过电极表面时，发生氧化还原反应，产生电量（Q）的大小符合法拉第定律：Q=nFN。因此反应的电流（I）为
n：每摩尔物质在氧化还原过程中转移的电子数
F：法拉第常数 N：物质的摩尔数 t：时间
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(4) 蒸发光散色检测器
evaporative light scattering detector; ELSD
流动相
（样品）
加热
流动相蒸发除去