用16S-rDNA方法鉴定细菌种属.doc

用16S-rDNA方法鉴定细菌种属
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的
用16S-rDNA方法鉴定细菌种属
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制 链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
二、操作步骤
1、细菌基因组DNA提取；
2、PCR扩增；
3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；
4、扩增片段回收；
5、DNA片段测序。
三、结果处理与分析
在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，，，，则凝胶为400mg，因此加入的Binding Buffer为1200μl。
我们小组选用B1 16S sequence，以下为制作进化树过程：
1、根据B1 16S 基因序列，到NCBI 上比对，确定其种属
（1）NCBI 主页（/）依次点击进入BLAST
（2）选择nucleotide BLAST
将B1 序列复制到文本，框里Choose Search Set 处点复选按钮others，最后点BLAST
点击BLAST后，数据进行提交。BLAST 结果如下：
图中“Evalue” 指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totle score）都是数值越高相似度越高。
我组将数据按照Query cover从100%开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。
（5）导出数据
数据导出格式选择FASTA：
选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌
下载MEG并安装，，并将B1序列导入MEG
通过Edit中的Copy及Paste将B1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中
选择W 中Align DNA，然后点击OK
（10）选择Date中的MEGA Format，生成meg文件

生成进化树
导出文件，我组导出PDF格式
进化树
B1应该属于Proteus（变形杆菌属）
电泳图谱：
从右数第四个条带为本组电泳条带，条带清晰且明亮，无明显拖尾以及弥散，表明DNA提取和PCR扩增非常顺利，所得目的片段完整，数量较多。
四 交流与讨论
，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于
分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此我们选择16S rRNA进行提纯测序
，一定要注意盒内药品名称，不要弄错
，加入GA缓冲液后，一定要小心吹打混匀，但要注意不要产生气泡。
，第一步要先加水，因为DNA液和其他药品太少，不事先加水，会是使其他样液加到离心管壁上或根本加不进来，造成样液损失。
，但是PCR产物条带清晰明亮，同时并无拖尾现象，说明我组DNA扩增之后含量很高，而且质量也很好
：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+作为聚合激活剂）。
通过这次实验我学到了鉴定细菌种属的一种方法，16Sr DNA法，虽然按照试剂盒进行实验操作非常简单，但这次实验的目的并不在于完成一次实验得到实验结果，而在于通过这一次实验学会举一反三，切实地应用到以后的科研实验中去。
关于试剂盒的使用，我们不仅要明白如何使用，更要清楚其原理，明白用代称命名的一些试剂的用途以及可能成分，这非常有利于以后的科研工作。同时，操作过程中严格按照步骤进行，注意试剂的使用不要出错。
电泳图谱中第一块胶