免疫共沉淀详细顺序.pdf

精心整理
免疫共沉淀详细步骤
实验原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互
作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体Cl：150mM
EDTA：1mM
PMSF：1mM
抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各 1μg/ml
Na VO ：
3 4 1mM
NaF：1mM
实验步骤
准备工作：
预冷 PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机
PBS 洗涤细胞两次，最后一次吸干 PBS；
RIPABuffer(1ml/107 个细胞、10cm 培养皿或 150cm2 培养瓶，
×106 个细胞、6cm 培养皿、75cm2 培养瓶)；
，把悬液转到 管中，4℃，
缓慢晃动 15min（EP 管插冰上，置水平摇床上）；精心整理
℃，14000g 离心 15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；
ProteinAagarose，用 PBS 洗两遍珠子，然后用 PBS 配制成 50%浓度，建议
减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；
1ml 总蛋白中加入 100μlProteinA 琼脂糖珠（50%），4℃摇晃 10min（EP 管插
冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景；
℃，14000g 离心 15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除 ProteinA 珠子；
8.(Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释 1：10 倍以
上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）；
PBS 将总蛋白稀释到约 1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白
在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如 10μg/μl）；
500μl 总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞
系中的多少而异；
℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2h
室温孵育；
100μlProteinA 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合
物过夜或室温 1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加 2μl"过渡抗体"（兔抗鼠 IgG，
兔抗鸡 IgG）；
瞬时离心 5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的
RIPAbuffer