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[pcr技术]PCR技术原理
篇一 : PCR技术原理
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理及步骤
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步骤
篇二 : 性
?引物量:
– ~ 1umol或10 ~ 100 pmol， 以最低引物量产生所需要的结果为好 – 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，
且 可增加引物之间形成二聚体的机会
引物设计的原则
? RT-PCR 引物设计特别注意:
– 跨越两个外显子
酶及其浓度
? 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应
– 天然酶:从栖热水生杆菌中提纯 – 基因工程酶:大肠菌合成
? 一个典型的 PCR反应约需酶量 ? 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则 合成产物量减少
dNTP 的质量与浓度
? dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效
率有密切 关系
– dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 – dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到 ,，小量分装，-20?冰冻保存。多次冻融 会使dNTP降解 – 在PCR反应中，dNTP应为50,200umol/L，尤其 是注意4种dNTP的浓度要相等， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时，
就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量 – dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低
模板
? 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否 的关键环节之一 ? 传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶 K 来消化处理标本
– SDS 的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白 质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞 中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀 – 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合 的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质 和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸
模板
? 提取的核酸即可作为模板用于PCR反应 ? 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法 溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的 蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增
? RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K法，要防止RNase降解RNA
2+浓度 Mg
? Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影 响 ? 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为 200umol/L时，Mg2+, mmol/L 为宜 ? Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特 异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶 的活性，使反应产物减少
PCR反应条件的选择
? PCR反应条件:
– 温度 – 时间 – 循环次数
温度与时间的设置:
? 设置变性-退火-延伸三个温度点 ? 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在 90,95?变性，再迅速冷却至40 ,60?， 引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温 至70,75?，在Taq DNA 聚合酶的作用下， 使引物链沿模板延伸 ? 对于较短靶基因 可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合 二为一，一般采用94?变性，65?左右退火 与延伸
? 变性温度与时间:
? 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败 的最主要原因 ? 一般93?,94?lmin足以使模板DNA变性
– 若低于93?则需延长时间 – 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。
? 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全 变性，就会导致PCR失败
? 退火温度与时间:
? 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 ? 变性后温度快速冷却至40?,60?，可使引 物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物 复杂得多，引
物和模板之间的碰撞结合机会 远远高于模板互补链之间的碰撞
? 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基 组成及其浓度，还有靶基序列的长度
? 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物， 55?为选择最适退火温度的起点较为理想
引物的复性温度
通过以下公式帮助选择合适的温度:
? Tm值=4，2 ? 复性温度=Tm值-
– 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性
? 复性时间一般为30,60sec，足以使引物与 模板之间完全结合
? 延伸温度与时间:
? Taq DNA聚合酶的生物学活性: 70,80? 150核苷酸/S/酶分子 70? 60核苷酸/S/酶分子 55? 24核苷酸/S/