碱性磷酸酶km值测定实验报告
篇一:碱性磷酸酶Km值得测定和分子筛层析
碱性磷酸酶Km值得测定
实验目的
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;
实验原理
1层析的基本操作技术。
实验原理
,它们的内部有很细微的多孔网状构造。
,大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外,而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状构造,流速缓慢,以至最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同样的物质得到分离。
-25,以水为洗脱溶剂,层析分离大分子蓝葡聚糖(M>200万)和小分子黄色重铬酸钾(M=294)。
实验仪器和试剂
仪器:层析柱,试管架,铁架台,试管,小烧杯,胶头滴管 试剂:葡聚糖凝胶,蓝色葡聚糖,黄色重铬酸钾,蒸馏水
篇二:碱性磷酸酶米氏常数的测定
碱性磷酸酶米氏常数的测定
实验目的通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)米氏常数的测定,理解其测定措施和意义。学会运用原则曲线测定酶的活性及观测克制剂对酶促反映动力学的影响,加深对酶促反映动力学的理解。
实验原理本实验以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐。 酚在碱性条件下和4-氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化,生成红色的醌衍生物,颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值的大小可以计算出酶的活性,也可以从原则曲线上查知酚的含量,进而算出酶活性的大小。
实验环节1. 底物浓度对酶促反映速度的影响 (1) 取6支试管,作好标记。按下表操作:(未加克制剂组)
(2) 加入酶液()后,各管混匀并立即记录时间,将上述各管置37℃水浴中正保证
温
15分钟。
(3) 保温结束, ml终结反映。
(4) % 4- ml,% ml,充足混匀,放置
10分钟,以6号空白管作对照,于510 nm波长处比色,根据酚原则曲线计算酶活性。 (5) 以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标,以各管吸光度值的倒数或以酶活性单位的倒
数为1/V做横坐标,作图求出Km值。
(1) 取干净干燥试管6支,按下表依次加入试剂:
(2) 混匀后室温放置15分钟,于510 nm波长处比色。
实验成果和分析
1????????
得到拟合直线方程:y=+ 根据
1??
=
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?+
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1
可得到:
????????=1/=, ????=????????*=
得到拟合直线方程:y = + 根据
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可得到:
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分析:由上述图表来看,在加入高精氨酸克制酶活性后,酶的Km值增大,Vm值也增大 实验讨论
1. 在实验过程中,滴加试剂和反映时间的控制一定要对的,以保证得到对的的实验成果。 2. Km值指最大反映速率一半时底物浓度,它只和酶的构造、反映物和环境有关,而和酶的
浓度没有关系;因此Km值可以表达酶和底物之间的亲和力,Km值越小,亲和力越高,越容易反映;反之,值越大,亲和力余地,越不易反映。
篇三:酶促反映动力学实验报告
酶促反映动力学实验报告
********** 杨恩原
实验目的:
1. 观测底物浓度对酶促反映速度的影响
2. 观测克制剂对酶促反映速度的影响
3. 掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值
实验原理:
一、底物浓度对酶促反映速度的影响
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下,底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。在一般状况下,当底物浓度很低时,酶促反映的速度(v)随底物浓度[S]的增长而迅速增长,但当底物浓度继续增长时,反映速度的增长率就比较小,当底物浓度增长到某种限度时反映速度达到一种极限值(即最大速度Vmax)。底物浓度和反映速度的这种关系可用米氏方程式来表达(Michaelis-Menten方程)即:
式中Vmax为最大反映速度,Km为
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