9-组蛋白(去)乙酰化.docx

分子机制研究套路（九）
组蛋白（去）乙酰化
课题：组蛋白乙酰转移酶A在B基因转录调控中的作用
1．概念介绍：表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多主要包括DN活B基因启动子的过程中，它的乙酰转移酶活性是必需的。A^HAT与报告基因质粒共转染时，对B基因启动子的转录激活作用显著减弱，更进一步明确了A的乙酰转移酶活性在B基因启动子的转录激活中是必不可少的。
注释：1）此步骤中关于组蛋白乙酰转移酶A的推断，需根据文献调研或选择不止一个可能候选者，进行逐一排查，但实验方法同上。
2）关于腺病毒癌蛋白E1A，根据组蛋白乙酰转移酶A的不同，可能会有所变化，如果无法找到可与组蛋白乙酰转移酶A的HAT区结合从而抑制A的HAT活性的蛋白，则此部分可省略。
,过表达A蛋白能升高细胞内源性B基因mRNA水平前面已证实A蛋白对B基因启动子报告基因的激活作用，A蛋白是否对內源的B基因表达也发挥作用，还需要进一步的实验来揭示。如果能发现A蛋白确实与B基因启动子结合，那将是最直接的证据。染色质免疫沉淀（CHIP）实验结果显示：在B基因启动子上确实有乙酰转移酶A蛋白存在。
在证实了A蛋白确实能与B基因启动子结合后，接下来对A蛋白激活內源B基因转录的功能进行进一步考察。用A蛋白表达质粒转染cell-1细胞，使A蛋白在cell-1细胞中过量表达，提取细胞RNA，Real-timePCR分析细胞内B基因mRNA的水平，结果显示：A蛋白过表达细胞中B基因的mRNA水平显著高于对照组，与HDAC抑制剂NaBu处理的结果相近。

Sp1是哺乳动物遍在表达的转录因子，参与大量基因的转录调控，它能与靶基因启动子区的富含GC的元件相互作用，既能激活基因转录，又能抑制基因的转录究竟发挥哪种作用取决于它结合的元件及与之作用的辅因子。在B基因启动子上游-164/-158和-146/-139有2个可能的Spl结合序列GGGAGGG，为弄清Spl蛋白是否真的与这两个序列结合，通过电泳迁移率（EMSA）分析。
首先体外合成了包含上述两段序列的寡核苷酸链，野生型：5-CCAGAGCTGGGGGAGGGGGTACACTAGAGGGAGGGGCTACTTTGG3；突变体：5-ccagagctgggggAAAGggtacactagagggAAAggctactttgg3。以生物素标记制备探针，将Sp1表达质粒转染293T细胞，培养24h后提取核蛋白，进行EMSA分析。
结果显示：核提取物使含有2个可能Sp1位点的探针发生凝胶电泳迟滞现象；当实验体系中再加入100倍的未标记探针时，迟滞现象消失，竞争实验说明该迟滞现象确实是我们所研究的探针与核蛋白结合产生的；那么，核提取物中与探针结合的蛋白究竟是不是Sp1呢？为回答这个问题，在实验体系中加入Sp1抗体，如预期所料，由于抗体的特异性结合使探针-蛋白质复合物的质量增大，因此在电泳中发生了super-shift现象；为了证实Sp1与探针结合的位点确实是2个可能的Sp1位点，通过位点突变的探针代替野生型探针，再做EMSA实验，结果无法观察到用野生型探针时所看到的迟滞带。以上所有结果充分说明了B基因启动子上这