5-氮-2′-脱氧胞苷诱导膀胱癌EJ细胞凋亡研究.doc

1 5- 氮-2′- 脱氧胞苷诱导膀胱癌 EJ 细胞凋亡研究【摘要】[ 目的] 探讨 5-氮-2′- 脱氧胞苷( 5-Aza-CdR ) 诱导膀胱癌 EJ 细胞凋亡机制。[ 方法] 以不同浓度的 5-Aza-Cd R 作用于膀胱癌EJ 细胞, 以四甲基偶氮唑蓝( MTT ) 法检测细胞的增殖程度,原位凋亡细胞检测技术(TUNEL) 和流式细胞术(FCM) 检测 5-Aza-Cd R 对膀胱癌EJ 细胞凋亡和细胞周期的影响。[ 结果]EJ 细胞加入不同浓度的 5-Aza-CdR ( , , , ), 与对照组相比各组 EJ细胞增长速度减慢。与对照组相比,不同浓度的各组 5-Aza-CdR ( , , , )可以显著降低 EJ 细胞的增殖比和增高 EJ 细胞的凋亡指数() ,且与 5-Aza-CdR 呈浓度依赖关系() ;不同浓度的 5-Aza-Cd R 作用 EJ 细胞后 G0/G1 期细胞明显增加() 。[结论] 5- 氮-2′- 脱氧胞苷诱导膀胱癌 EJ 细胞凋亡并使 EJ 细胞阻滞于 G0/G1 期,从而抑制膀胱癌 EJ 细胞的增殖。【关键词】 5-氮-2′- 脱氧胞苷膀胱肿瘤凋亡 2 Study on EJ Cells ’ Apoptosis Induced by 5-Aza-2 ′-decxycytidine ( 5-Aza-CdR ) 5-氮-2′- 脱氧胞苷( 5-Aza-2 ′-decxycytidine , 5-Aza-CdR )是一种特异性甲基转移酶抑制剂, 通过去甲基化作用可使多种 CpG 岛高甲基化的抑癌基因重新表达,恢复抑癌功能。但 5-氮-2′- 脱氧胞苷是否可以通过诱导肿瘤细胞凋亡达到治疗肿瘤尚少见报道。本研究以膀胱癌 EJ 细胞株为研究对象, 以不同浓度的 5-Aza-CdR 作用于 EJ 细胞,观察 5-Aza-Cd R 对 EJ 细胞凋亡和细胞周期的影响,为膀胱癌的治疗提供新的线索。 1 材料与方法 材料膀胱癌细胞株 EJ 细胞购自北京大学泌尿外科研究所。 5-Aza-CdR 购自 Sigma 公司; PRMI1640 培养基、新生牛血清购自 GIBCO 公司; 原位凋亡细胞检测技术( TdT-mediated dUTP nick-end labeling , TUNEL )试剂盒购自武汉博士德公司。其它试剂均为分析纯。 3 实验方法细胞培养:将复苏的 EJ 细胞培养于含 10% 新生牛血清的 PRMI1640 培养基中, 37°C, 100% 湿度, 5%CO2 , 95% 空气, 每 24h 换液 1 次。四甲基偶氮唑蓝( MTT )法检测细胞增殖程度: 将培养的 EJ 细胞按随机原则分为对照组与实验组。当细胞达到亚融合状态时,常规制成单细胞悬液,以 5000 个/ 孔将细胞接种于 96 孔板, 每组 4 个平行孔。培养 24h 后,4℃冰箱 2h, 使细胞同步化。弃去培养液每孔按分组要求分别加入不同量的 5-Aza-CdR(1mg/ml) 及无血清培养液,使各孔的终体积均为 200 μl, 各组 5-Aza-CdR 的终浓度分别为 0、 、 、 及 5mg/ml, 每一浓度重复 4孔。 37℃, 5%CO2 , 培养 48h 后弃去培养液, 各孔加入 MTT20 μ l(5mg/ml) , 37℃孵箱 4h; 各孔加入二甲基亚砜 150 μl, 避光振荡 10min , 酶标仪 640nm 波长测定各孔吸光值, 以增殖比( proliferation ratio ) 表示增殖程度(增殖比= 实验组吸光值/ 对照组吸光值× 100% )。原位凋亡细胞检测技术检测细胞凋亡: 采用六孔板盖玻片培养法, 调整细胞密度至 5× 104/ 孔, 培养 24h 后, 吸弃培养液, 每孔按分组要求分别加入不同量的 5-Aza-CdR 和无血清 4 培养液,使各孔的终体积均为 2ml ,每组 4 个平行孔,各组 5-Aza-CdR 的终浓度分别为 0、 、 、 及 5mg/ml 。 37℃, 5%CO2 ,培养 48h 后,以 4% 多聚甲醛固定,按原位凋亡细胞检测试剂盒中说明书进行操作, 细胞核呈棕黄色染色判定为凋亡细胞。光镜下随机选取 10 个视野计数 1000 个细胞。凋亡指数( apoptotic index , AI )= 凋亡细胞数/ 总细胞数× 100% 。流式细胞术( flow cytometry , FCM ) 检测细胞周期时相变化: 用培养瓶培养细胞, 按照随机分组原则, 将培养