1.1植物根系酸性磷酸酶活性测定.doc

植物根系酸性磷酸酶活性测定 1. 原理该方法以对硝基苯磷酸二钠(即 p- NPP )为底物, 该底物在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色的对硝基苯酚(即 p- NP ) ,该黄色溶液在 410nm 处有最大吸收光值, 根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析, 以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性。酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解 p- NPP 生成的对硝基苯酚( p-NP ) 的量来表示(μg·h -1·g -1 鲜根或μg·h -1/株)。 2. 测定方法 1) 称取( ± )g 鲜根, 加入 8 mL 醋酸钠缓冲液( pH ), 然后进行冰浴研磨,双层纱布过滤, 12000 r/min 离心 15min ,静置。 2)取上清液 1mL 于 15mL 离心管中,加入 2mL 对硝基苯磷酸二钠( 醋酸钠缓冲液配制) ,摇匀后加盖,于 37℃水浴 30min 。 3) 水浴后加入 2mL CaCl 2及 2mL 2mol/L NaOH 以终止反应,摇匀。 4) 2500r/min 离心 5min ,取上清液于 15mL 离心管中, 4000r/min 下再离心 5min 。 5) 取上清液在 410nm 波长比色,并记录吸光值 A 410。 3. 标准曲线的制作 1)取 13支 15mL 离心管,按顺序编号,并按表 1 加入试剂。表1 对硝基苯酚标准曲线配制表离心管号 0123456 μ mol/mL pNP ( mL ) 0 H 2O( mL ) pNP 含量( μ mol )0 离心管号 789 10 11 12 μ mol/mL pNP ( mL ) H 2O( mL ) pNP 含量( μ mol ) 摇匀 醋酸钠缓冲液 8 CaCl 2( mL )2 2mol/L NaOH ( mL )2 2) 混匀后,在 2500r/min 下离心 5min , 再在 4000r/min 下离心 5min 以 0 号作为对照, 在 410nm 波长下测光吸收值,