2质粒DNA的酶切鉴定.ppt

2质粒DNA的酶切鉴定
由NordriDesign提供

第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA。
注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套!!!
3. 实验材料与仪器
质粒 pCMV-Myc-T10
NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)
EcoRI 和 XhoI 核酸内切酶（Takara）
EcoRI和 XhoI酶解缓冲液(10×H buffer)
琼脂糖
TBE或TAE缓冲液(10×)
溴化乙啶染色液(10mg/ml)
上样液(6×)：% 溴酚兰，40％(W/V)蔗糖 水溶液或30％的甘油。
Insert
EcoRI
XhoI

质粒
1 kb DNA Ladder不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大致的量如下（。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍）：
1 kb DNA Marker
片段
碱基对
质量
1
10,002
42 ng
2
8,001
42 ng
3
6,001
50 ng
4
5,001
42 ng
5
4,001
33 ng
6
3,001
125 ng
7
2,000
48 ng
8
1,500
36 ng
9
1,000
42 ng
10a
517
42 ng*
10b
500
42 ng*
EcoR I 酶切位点：G'AATT_C
Xho I 酶切位点：C'TCGA_G
10×H buffer: 500mM Tris-HCl()
100mM MgCl2
10mM Dithiothreitol
1000mM NaCl
酶活性的定义：
一个活性单位（U)，是指在50l反应体系中，37oC的条件下，经过1小时的反应时间，将1g DNA 完全酶解所需要的酶量。
因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。
电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等
仪器设备
4. 实验方法和步骤
质粒量（ng）
缓冲液
(μl)*
EcoR1
（μl）
Xho1
（μl）
H2O
(μl)
总体积（μl）
I
200
2
0
0
17-19
20
II
200
2

0
15-17
20
III
200
2


14-16
20
* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 H buffer。
置于37℃-1小时。酶解完成后，分别加入10l 3倍的上样缓冲液, 然后各取15l进行电泳分析。
1) 质粒DNA的酶解（自提质粒pCMV-Myc-T10）
2) 琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶液的制备：，置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。
3）胶板的制备
取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。
将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。-1×TAE（Tris-乙酸） 或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。
4）加样
用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约15～20 l。
1 kb DNA ladder（能见到10条带）: 在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6l 的 1 kb DNA ladder（50ng/l ）。
5）电泳（带上手套操作）
加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；
建议在80～100V的电压下电泳；
当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm