实验五质粒酶切质粒限制性内切酶消化酶切.ppt

关于实验五质粒酶切质粒限制性内切酶消化酶切
第1页，讲稿共29张，创作于星期日
背景知识
一、质粒图谱的阅读
二、限制性内切酶
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第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真activity)
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① DNA样品纯度
A）样品杂有RNA 虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段电泳观察。
B）少量的蛋白质污染 对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。
C）样品中杂有其他DNA 如质粒DNA中杂有染色体DNA，虽不影响酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。
D）其他杂质 如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。
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② DNA样品甲基化程度
限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应，则该DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一， DNA甲基化现象广泛的存在于原核和真核生物中。
如：
AccⅠ识别序列
能切割
不能切割
注意此处的区别
dam甲基化酶识别序列
AccⅠ
T CCGG AGA
T ×CCGG 6mATC
采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。
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③ 酶的星活性 (star activity)
又称第二活力，是指改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的一种现象。由于识别特异性的降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割反应。
　　高浓度甘油、高pH、低离子强度、巯基乙醇、DMSO、Mn2+ 等的存在可能导致酶产生星活性。
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6) Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
　　①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶；加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时酶易产生星活性。
　　②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。
　　③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。
　　④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液；若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
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实验目的
１）了解酶切原理，掌握酶切体系建立原则
２）用EcoR Ⅴ 切割质粒pCAMBIA1302
3）用EcoR Ⅴ切割银杏基因组DNA
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实验原理
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。
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限制性内切酶EcoR Ⅴ 特异性识别位点为：
GAT　　ATC
CTA　　TAG
GATATC
CTATAG
产生平末端：
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则pCAMBIA1302经EcoR Ⅴ酶切后产生大小分别为：1600bp、2624bp和6325bp的三条DNA 片段
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基因组DNA中由于有较多的EcoR Ⅴ识别位点，因此，经EcoR Ⅴ酶切后产生大小不一的条带，电泳后整个泳道呈现均一的亮带。
酶切前的DNA
酶切后的DNA
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实验材料和试剂
实验材料：质粒pCAMBIA1302
银杏基因组DNA
实验试剂：
EcoR Ⅴ酶及其酶切缓冲液
琼脂糖(Agarose)、TAE电泳缓冲液等
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实验仪器
恒温水浴锅
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质粒 （DNA）
反应 10×缓冲液2μL
19μL

+
用移液枪轻轻吹打使溶液混匀，且使溶液集中在管底
混匀反应体系后，37℃水浴保温4-5h
１％琼脂糖凝胶电泳检测(上样10μL电泳)
EP管编号, 加样
实验步骤
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实验注意事项
限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当