RealtimePCR数据分析.pdf

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由于 Real-time-time qPCR 中的重要参数 Ct 值（ Ct value），阈值（ threshold），和
基线（ baseline）。一般来讲，第 3-15 个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引
起的。阈值一般是基线的标准偏差的 10 倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就
可以。Ct 值就是荧光值达到阈值时候的 PCR 循环次数。所以是一个没有单位的参数。
那么为什么说 Ct 值跟初始模板的量成反比呢？我们来看 PCR 的扩增方程：
从线性方程上看，斜率（ slope）为-1/lg(1+E)，所以 E=10-1/slope-1。如果从标准曲线
上得到斜率（ -），就可以算出扩增效率（ ）。一般来讲 PCR 扩增效率在 90%-110%
都是可以用于数据分析的。效率低于 100%，是由于 PCR 反应中存在抑制因素；而高于 100%
可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。
3. Real-time qPCR 的种类
根据 real-time qPCR 的化学发光原理可以分为 2 大类：一类为探针类，包括 TaqMan@
探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，
其中包括如 SYBR Green I或者特殊设计的引物(如 LUX Primers) 通过荧光染料来指示产物
的增加。
Taqman 探针法
Taqman 探针是最早用于定量的方法。就在 PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个
特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭
荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是 FRET 反应；PCR
扩增时，Taq 酶的 5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，
从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实需要样品少
特异性高
精确定量
三、Real-time qPCR 实验设计
实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间！尤其做生物
实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。当然实验过程中
出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。对于一个
real-time qPCR 而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后引物设计，这步至关重要，好
的引物是实验本身成功的 50%；进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。
1. 实验材料的处理和准备
以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。
组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免
RNA 的降解（尤其对于绝对定量的样品）。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保
存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。现在新技术的发展，也有一些非液氮类的
样品储存液，比如百泰克的 RNAfixer 。
2. 引物设计
一般 real-time PCR 引物的设计遵循下面一些原则：
扩增产物长度在 80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在 15-30 碱基之间。
G+C 含量在 40%-60%之间。
碱基要随机分