徕卡sp8x白激光共聚焦显微镜操作规程.docx

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徕卡SP8 X白激光共聚焦显微镜操作规程

Microscope、Scanner Power、Laser Power三个按钮，将Laser Emission上的激光开关钥匙旋至On-1公共实验室
徕卡SP8 X白激光共聚焦显微镜操作规程

Microscope、Scanner Power、Laser Power三个按钮，将Laser Emission上的激光开关钥匙旋至On-1。 图1
图1
，打开需要的激光电源。图2
图2
X图标，启动共聚焦操作软件，进入配置选择界面后，点击OK，软件进行系统自检；
，进入LAS X操作界面，点击界面最上方Configuration按钮进入Laser Config界面→打开所需激光（OFF→ON），Argon激光还需拖动右方滑块以调节激光输出初始功率；
xy二维及xyz三维图像扫描程序
，轻轻移动载物台样品夹，盖玻片朝下放置样品。先使用粗聚焦旋钮聚焦样品，接近样品时换成细聚焦旋钮。旁边有一个开关，可在粗和精细移动之间切换（精细速度确实很慢）。在目镜下采用相应的滤块，通过smart move找好样品的焦距和感兴趣视野
关于载物台：这是非常精密的振镜扫描仪galvo-scanner，切记，不能用手压或者放置重的物体。它偶尔产生高频声音，是因为载物台没平衡好，无法对任何机械漂移进行补偿，在XZY和XYZ模式之间切换有助于稳定平台。
关于物镜选择：选择63x物镜，不要
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选择100x物镜用于普通共聚焦成像，因为他们的数值孔径一致。共聚焦显微镜的“放大倍数”由扫描区域而不是物镜决定。
扫描模式，可用于xy二维单张扫描（未设置z-stack参数时）和xyz三维层切扫描（设置z-stack参数时）
、发射光接受范围（如GFP采用488nm激光，发射光接受范围500-550nm）、检测器增益（PMT增益一般不超过800v，HyD增益一般不超过100%），针孔大小（一般为1AU），平均次数（2-4次）；
关于HyD: Counting模式输出的是检测到的光子数；Standard模式输出的是检测器上的累积电荷；BrightR模式是检测弱信号。Counting模式对弱信号特别有用，因为它可以提供更好的信噪比（该模式下最好选择accumulated参数）。Gating是两个白激光脉冲（80 MHz）之间的间隔（ ns）。可以用来去除自发荧光。
：如果两个荧光发射光谱有重叠，例如YFP和mCherry，DAPI和GFP，可以通过一次激发一个荧光的序列扫描Sequential scan来解决。选择SEQ【B1】，在每个序列中，选择使用相应的激光和探测器，并选择序列之间的切换是每行、每帧或每个stack。每行的切换速度最快‎‎，所有荧光通道几乎同时‎预览。
：调节format至512×512，点击Live活图预览，调至合适的成像焦面及zoom放大倍数，通过改