《蛋白质分子结构》.ppt

氨基酸与多肽
氨基酸的通式和构型(氨基酸，L构型)
几种特殊的氨基酸(酸性、碱性、带芳香环)
氨基酸的两性电离和等电点pI
氨基酸氨基参与的反应(凯式定氮法，烃基化)
氨基酸羧基和氨基参与的反应(茚三酮显色)
氨基酸R基参与的反应NB法)
1945年由Sanger
发明此法
曾用此方法测
定了胰岛素的
N -末端
氨基酸N末端分析
DNP-氨基酸(黄色)对酸水解远比肽键稳定
多肽链上的-NH2、酚OH也能与DNFB反应，但是产物经过有机溶剂萃取后与游离氨基酸留在水相，易与-DNP氨基酸区分开
精选课件
二甲氨基萘磺酰氯法(DNS法)
1956年由
Hartley等
提出
灵敏度较高(具有荧光性质，
比FDNB法提高100倍)
样品量小于1纳摩尔
DNS-氨基酸稳定性较高
此法优点
氨基酸N末端分析
精选课件
苯异硫氰酸酯法(Edman法)
氨基酸N末端分析
反应分为偶联、环化断裂和转化三步
Edman测序一次能连续测定60~70个残基的序列
精选课件
亮氨酸氨肽酶（Leucine amino peptidase, LAP）
专一性:
A=非极性氨基酸时 快
A=其它氨基酸时 慢
A B
N端
A=Leu时 最快
氨基酸N末端分析
氨基酸N末端分析
精选课件
多肽N端封闭
在序列测定中，经常会碰上N端残基的氨基被封闭，不能与PITC试剂反应
N端封闭的种类很多，如焦谷氨酸酰化、乙酰化以及某些环肽(如短杆菌肽S)的N和C末端连接成环等
精选课件
C-末端分析
肼解法
还原法
羧肽酶法
氨基酸末端分析
精选课件
肼解法
氨基酸C末端分析
蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C端氨基酸以游离形式存在外，其他的氨基酸都转化为相应的氨基酸肼化物
反应中生成的氨基酸酰肼可与苯甲醛作用生成不溶于水的二苯基衍生物而沉淀，上清中的游离C端氨基酸可借助FDNB或DNS法以及层析技术鉴定
Gln, ASn ,Cys被破坏不易测出，C端Arg转变为鸟氨酸
精选课件
还原法
氨基酸C末端分析
肽链C端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的-氨基醇。肽链完全水解后，可用层析法加以鉴定
Sanger早期采用该法鉴定胰岛素A链和B链的C端残基
精选课件
羧肽酶法
主要方法
根据氨基酸释放的动力学曲线，
可确定该肽链的C端氨基酸顺序
氨基酸C末端分析
精选课件
羧肽酶(Carboxypeptidas)法
A-----B
氨基酸C末端分析
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4种羧肽酶的来源和专一性
羧肽酶
来源
专一性
CpA
牛胰脏
能释放除Pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸
CpB
猪胰脏
主要水解C端为Arg或Lys的肽键
CpC
植物或微生物
相当广泛，几乎能释放C端的所有氨基酸
CpY
面包酵母
可释放C端所有氨基酸
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则其氨基酸排列顺序为：
Thr-Val-Lys-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys
如测一个八肽
测得N端氨基酸残基为Thr
又分别测得片断:
Ala-Ala-Trp-Gly-Lys  Val-Lys-Ala-Ala-Trp
Thr-Asn-Val-Lys
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二硫键的定位
二硫键的定位
将含二硫键的肽段进行酶解，分离出含二硫键的肽，对该肽进行氧化或还原，切断二硫键，生成二个小肽段，将这两个小肽段与原肽链氨基酸顺序进行比较，即可确定二硫键位置
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二硫键位置的确定
对角线电泳
1. 胃蛋白酶水解(专一性低，切点多，作用pH在酸性范围，有利于保持二硫键完整)
2. 对角线电泳
(a) pH 一相电泳
(b) 暴露于过甲酸蒸汽后，断裂二硫键,形成含磺基丙氨酸的肽，进行第二相电泳
如何区分分子间和分子内的二硫键？
问题：
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蛋白质一级结构测定流程
完整蛋白
拆分亚基
亚基蛋白
多肽片段
水解分离片段
多肽序列
亚基蛋白序列
多肽序列测定
片段重叠
蛋白质一级结构
二硫键测定
氨基酸组成分析
末端测序
精选课件
蛋白质测序新方法
生物质谱法
软电离方式结合惰性气体碰撞的多级串联质谱(MS/MS or MSn)
核酸序列测定法
通过基因中核苷酸的序列推测蛋白质的氨基