浅述奶牛传染病检测和预防措施.doc

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浅述奶牛传染病检测和预防措施
一、材料与方法
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乙型肝炎诊断试剂盒购于上海某生物有限公司;牛传染性胸膜肺炎补体结合反应抗原、标准阴性血清和阳性血清、溶血素补体由某生物制品厂提供;牛传染性鼻气管炎抗原、IBR弱毒株、阳性血清购于中国兽医药品监察所,阴性血清取自检查牛;奶牛血清来源于某省市的奶牛场和奶牛专业户。

(1)酶联免疫吸附试验检测奶牛类人乙型肝炎
①每孔加入待检样品50μL,设阴、阳性对照各2孔,每孔50μL,并设空白对照1孔。②手工洗板,弃去孔内液体,洗涤液注满每孔静置5s,甩干、重复5次。③每孔加入酶结合物50μL(空白对照除外),充分混匀,封板,置37℃孵育30min。④重复操作②。⑤每孔加显色剂A液、B液各50μL,充分混匀,封板,置37℃孵育15min。⑥每孔加入终止液50μL,混匀。⑦用酶标仪读数,取波长在450nm,先用空白孔校零,然后读取每孔D值。
(2)类人乙型肝炎病理形态学观察
用肝脏穿刺法观察类人乙型肝炎病理形态学。用长12~15cm,内径3mm的长注射针头对20头奶牛11~12肋间进行穿刺,取肝脏组织活体样本,将其保存于10%福尔马林中。同时解剖HBsAg、HBeAg双阳性奶牛,做病理切片观察。用HE、VanGieson-氏、过碘酸一苯肼Schiff(PAS),同时用透视电镜做超微结构观察。另将一部分肝脏组织活体样本放在灭菌的平皿中,剪碎研磨,用灭菌生理盐水稀释后,,置Eppendorf管中,经差数离心和饱和硫酸铵沉淀,初提物再经150、300、500g/L蔗糖梯度离心,PEG浓缩后,负染,电镜观察病毒颗粒。
(3)补体结合反应检测牛传染性胸膜肺炎
血清(包括被检血清(样品血清)、阳性血清(补体结合试验标准血清)、阴性血清(补体结合试验标准血清)、致敏红细胞(对照)、抗原(对照)孔分别加入抗原(补体结合试验抗原),阴性血清对照孔、致敏红细胞对照孔不加抗原;然后分别加入补体,致敏红细胞对照孔不加补体;再加入灭菌巴比妥缓冲液,振荡混匀后置37℃水浴30min;再加入6%致敏红细胞(绵羊红细胞与15个单位的溶血素混合液),振荡均匀后置37℃30min,2000r/min离心5min,观察结果。
二、试验结果

(1)奶牛肝功能检测
对HBsAg、HBeAg双阳性的奶牛进行肝功能检测,在10头双阳性中有8头的谷氨酸丙酮转氨酶(GPT)≥谷氨酸草酰酸转氨酶(GOT),GPT在400~600U/L之间,表现为急性病毒性乙型肝炎(AHB)。2头奶牛血清GPT缓慢上升,缓慢下降,GPT在200300U/L之间,表现为慢性病毒性乙型肝炎(CHB)。
(2)奶牛乙型肝炎病毒形态学观察
将HB-sAg、HBeAg双阳性奶牛肝脏组织做电镜观察,发现肝脏组织中有密集的HBV颗粒,包括大球形Dane颗粒、小球形颗粒、管球形颗粒3种。这些颗粒与人HBV的颗粒相似(图1)。
(3)奶牛乙型肝炎病理组织学观察
病牛肝脏主要表现为肝细胞的变性:胞浆疏松、气球样变(水肿变性)、脂肪变性、嗜酸性变、毛玻璃样变,肝细胞坏死,炎症