DNA RAN 琼脂糖凝胶电泳.ppt

核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳
目录
核酸
组成
理化性质
核酸分离、纯化的原则
核酸提取的基本步骤
材料准备
细胞裂解
分离、纯化
沉淀溶解
DNA提取的常用方法
RNA提取的常用方法
核酸的保存
琼脂糖凝胶电泳
核酸
DNA
RNA
Genomic DNA ( 原核、真核、病毒)
细胞器DNA ( 叶绿体、线粒体等)
质粒DNA ( 细菌、放线菌等)
mRNA ( 1%-5% )
rRNA (80%-85%)
tRNA(小分子RNA) (15%-20%)
核酸(nucleic acid)
核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。
核酸的理化性质
理化性质
DNA化学性质稳定,物理上易碎,粘度大
RNA化学性质比DNA活泼,易受RNA酶的污染
溶解性
均溶于水
不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀
核酸分离、纯化原则
1、保持核酸分子一级结构的完整性
温度不要太高
控制pH值范围(pH值5-9)
保持一定离子强度
减少物理因素对核酸的机械剪切力
核酸分离、纯化原则
核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键,破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌
提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂
2、防止核酸的生物降解
DNA酶抑制剂
金属离子螯合剂:
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活,常用EDTA(乙二胺四乙酸)离子螯合剂,可抑制DNA酶活性。
阴离于型表面活性剂
SDS除对核酸酶有抑制作用外,还能使蛋白质变性,并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物,该复合物有核酸酶抑制剂作用。
RNA酶(RNAase)抑制剂
DEPC(二乙基焦碳酸盐) 粘性液体,很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中His 结合使蛋白变性。
使用注意:
。
,保存在4 ℃或液氮中;
。
1:手指头
2:枪头
3:水/缓冲液
4:实验台面
5:内源 Rnase
6:RNA 样品
7:质粒抽提
8:RNA 保存
9:阳离子(Ca, Mg)
10:后续实验所用的酶
Rnase 污染的10大来源
DNA提取的基本步骤


、纯化