未知菌的鉴定.docx

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田博书2009302630018,崔明曜2009302630019杨帆2009302630023,彭慧2009302630024(学号排序,贡献同等)武汉大学生命科学学院生命科学与技术基地班,湖北,430072
【摘要】在本次实验中,我们首先从空气中分离出了一未知菌,纯培养之后进行了一系列的实验,包括对其形态、生理生化及16SrRNA基因等的测定,并在此基础上推断未知菌的科属甚至种。
【关键词】受试菌、革兰氏染色、鞭毛染色、生理生化实验
【前言】人类生活的环境中充满了各类各色的微生物,以细菌居多,霉菌和放线菌次之。在充满众多不同的微生物的环境中培养和分离单个菌株,用菌落形态特征观察,革兰氏染色鞭毛染色和理化试验等方式检验其性质,通过16srRNA序列的PCR分析和对比辅助判断,以此学习熟悉和巩固微生物实验的基本操作原理和技术。对今后的应用和科研很有帮助。
一、实验器材

受试菌

固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基
、试剂及器材草酸铵结晶紫染液、95%乙醇、沙黄复染液染剂、卢戈氏碘液、硝酸银染液
A/B液、蒸馏水;显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、盖玻片、滤纸、酒精灯、双层瓶(装有香柏油和二甲苯)
二、实验步骤
革兰氏染色
;
滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位,染色1~2min后倾去染液,水洗至流出水无色;
先用卢戈氏碘液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min,倾去碘液,水洗至流出水无色;
将玻片上残留水用吸水纸吸去,在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色。当流出液无色是立即用水洗去乙醇;
将玻片残留水用吸水纸吸去,用沙黄复染液染色2min,吸去残水晾干;
油镜观察:
在保证了阴性对照和阳性对照结果正常的情况下,受试菌镜检显红色,为革兰氏阴性菌。
鞭毛染色(硝酸银法)
制片:滴一滴水到洁净载玻片一端,用接种环挑取部分菌体,将菌体轻轻磕入水滴中,不能剧烈震荡,倾斜玻片,使菌悬液缓缓流向另一端,用吸纸吸去多余菌悬液,自然干燥;
染色:滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3-5min后用蒸馏水充分洗去A液。用硝酸银B
液洗去残留水分后,在滴加B液覆盖菌面数秒至一分钟,可用微火加热,当菌面出现银膜时,立即用蒸馏水冲洗,自然干燥;
:用油镜镜检观察。
淀粉水解试验
将固体淀粉培养基溶化后冷却至50°C左右,无菌操作制成平板;
(与枯草芽孢杆菌和大肠杆菌同时进行试验),并标记;
将平板倒置在适宜环境下培养一段时间后,观察细菌的生长情况,打开平板盖子,滴入少量卢戈氏碘液于平板中,轻轻旋转平板使碘液均匀铺满整个平板:如菌苔周围出现无色透明圈,说明淀粉已被水解,为阳性。
糖发酵试验
取半固体葡萄糖发酵培养基和半固体乳糖发酵培养基各一支(实验时与大肠杆菌和普通变形菌一起进行,故各三支);
半固体穿刺接种受试菌,标记后置于适宜环境培养;
观察培养基颜色(变黄为阳性,即产酸)和是否产气。
三、实验结果

菌落特征:圆形菌落呈金黄色,光滑粘稠有光泽,正反以及菌落中心颜色一致。
用接种环挑起后,菌团呈颗粒状,不易在载玻片上涂布。由此推测其外表有荚膜结构。好氧菌。
显微特征:短杆状
革兰氏染色:阴性
鞭毛染色:未观察到鞭毛
理化特征
淀粉水解试验:阴性
葡萄糖发酵试验:产酸、产气
乳糖发酵试验:不产酸、产气
16SrRNA基因PCR结果及网上比对结果:无,实验失败
四、实验结果分析
:革兰氏阴性、好氧、短杆状。在《伯杰细菌鉴定手册》[2]上确定其为“第七部分革兰氏阴性好氧杆菌和球菌”,但由其介绍为具鞭毛,这与鞭毛染色结果相悖,推测很可能是只具一根极生鞭毛或几根鞭毛使染色结果难以被观察到,当然,也可能是由于鞭毛染色实验所取菌体过老,或鞭毛染色过程中未注意到的失误使鞭毛断裂等原因所导致;
2•继续阅读《伯杰细菌鉴定手册》并比对实验结果,受试菌属于“科I假单胞菌科”与其他科部分性质不同;
3•在该科中检索,发现“属II黄单胞菌属”最为符合条件;
由于实验所限,无法再根据《伯杰细菌鉴定手册》进行受试菌种的判断,所以,从《伯杰细菌鉴定手册》出发,最后能得到的结论为:该受试菌为黄单胞杆菌。
本次实验我们没有得到16SrRNA基因PCR的结果,分析其失败原因可能为:制备的
DNA样品纯度不高,拷贝数降低,且含较多蛋白质;引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,这是PCR失败的常见原因;当然,还可能是物理因素或靶序列变异等原因。因为我们对PCR技术并不是很了解,所以难以具体进行分析,大略如此。
【致谢】在此,我们向谢志雄老师、器材准备老师以及助教们表达真挚的谢意!是你们的帮助才让我们顺利的完成了这些实验,谢谢!
【参考文献】
[1]沈萍,陈向东《微生物学实验》(第4版).北京:高等教育出版社,2007.
⑵,•中科院微生物研究所译.《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)•科学出版社,1984.