一代测序规范流程.doc

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锥形瓶
琼脂糖凝胶的熔化
容量瓶
溶液的稀释与试剂的配置
药匙和称量纸
试剂的称量
凝胶槽和凝胶梳
琼脂糖凝胶的凝固和加样孔的形成
计时器
计时
记号笔
做各种记号或标记
一次性手套
防污染和保护作用
铝箔
封96孔板
二、实验仪器
实验仪器
主要用途
制冰机
制冰
电冰箱
试剂的储存
高速台式离心机
试剂的离心
Mini式离心机
瞬离试剂
旋涡式混合振荡器
混匀试剂
电子分析天平
试剂的称量
核酸检测仪
核酸纯度和浓度的检测
PCR仪
PCR
电泳仪和水平电泳槽
琼脂糖凝胶电泳
凝胶成像仪
核酸琼脂糖凝胶电泳的检测和分析
基因分析仪
DNA的测序或片段分析
蒸汽式高压湿热消毒器
试剂、实验耗材及用具的消毒
电热鼓风干燥箱
实验用品的干燥
恒温水浴锅
提供恒温环境
三、实验操作具体步骤
(一)核酸的提取
按照DNA或RNA提取试剂盒操作(具体操作步骤参考试剂盒操作说明书),如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。
(二)测序PCR模板的制备
(1)、预先制备适量冰
(2)、在冰上融化模板DNA、引物以及ExtenderPCR-to-GelMasterMix
(3)、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上
成分
体积(20µl体系)
终浓度
ExtenderPCR-to-GelMasterMix,2×
10µl
1×
10µM上游引物
-2µl
-1µM
10µM下游引物
-2µl
-1µM
50ng/µl的模板
-1µl
5-50ng
ddH2O
根据需要
—
(4)将反应体系放入PCR仪,执行以下反应程序
95℃5min→
(95℃30sec,67℃30sec-℃/循环,72℃1min)x14循环→
(95℃30sec,57℃30sec,72℃1min)x30循环→
72℃7min→4℃Forever
(5)琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶,在微波炉上加热溶化,待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料,温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却,待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中,取少量PCR产物上样电泳,将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。
(6)将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I(ExoI),碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度,加入到PCR反应产物中,37℃消化15min,85℃使酶失活15min。纯化体系如下:
PCR产物
5µl
ExoI
µl
碱性磷酸酶
1µl
(三)、纯化后的PCR产物的测序反应
1、纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释(若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮,可以适当增大稀释倍数)
2、测序反应用引物稀释到1µM
(1)PCR产物测序反应体系(10µl):
成分
加入量
纯化并稀释好的PCR产物
1µl(也可参考下表)
引物(上游或者下游)1µM
1µl
BigDye()10倍稀释
8µl
总体积
10µl
PCR产物测序体系中PCR产物的加入量如下表:
DNA纯度:OD260/OD280=~;DNA含量(ng/µl)=OD260×50
PCR产物片段大小
加入量
100-200bp
1-3ng
200-500bp
3-10ng
500-1000bp
5-20ng
1000-2000bp
10-40ng
2000bp以上
20-50ng
BigDye()稀释10倍配方:
成分
加入量
BigDye()
50ul
SeqBuffer
225ul
ddH2O
725ul
(2)测序PCR循环条件:
一般测序:
96°C1min→
(96°C10sec→50°C5sec→60°C4min)x25循环→
4°C保温
大分子测序:
95°C5min→
(96°C30sec→50-55°C10sec→60°C4min)x50循环→
4°C保温
(三)测序反应产物纯化(酒精/EDTA法):
1、96孔板纯化方法:
(1)(pH=8),加到管底;
(2)加入30μL100%酒精,封严,震荡4次,室温放置15min;
20°C最大转速离心45min,马上倒置96孔板,倒置最小转速离心10s;
(3)加入60μL70%酒精,最大转速4°C离心15min,马上倒置96孔板,最小转速离心1min;
(4)70%酒精重复洗涤1次或2次;
(5)让残余的酒精在室温挥发干,加入10μLHi-Di甲酰胺,95°C变性4min,迅速置冰上4min,上样电泳。
2、:
(1),再加入30μL100%酒精,盖好,震荡4次,室温15min。
(2)台式离心机12000xg离心30min,马上用枪吸尽上清液。
(3)每孔加入60μL70%酒精,12000xg4°C离心15min,马上用枪吸尽上清液。此步可以重复1次。
(4)让酒精在室温挥发干净,加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA。
(5)在PCR仪上变性:95°C4min,4°C4min。上机电泳。
一般常见的纯化方式有三种:
(1)酒精/EDTA沉淀法:利用EDTA螯合定序反应中的Mg2+离子,再加入酒精,经离心后使定序产物小片段沉淀,游离的荧光物质则悬浮于上清液中,小心地将上清液除去,再经过一次的酒精清洗沉淀物,则可以完全去除游离的荧光物质。此法的优点是可以将游离的荧光物质去除的非常干净,几乎完全没有背景值会影响序列判读,然而,其缺点是无法保留小分子量的片段,约第20个碱基开始才可以被读取出来。
(2)酒精/EDTA/醋酸钠沉淀法:利用EDTA螯合定序反应中的Mg2+离子,再依序加入醋酸钠(帮助沉淀)、酒精,经离心后使定序产物小片段沉淀,游离的荧光物质则悬浮于上清液中,小心地将上清液除去,再经过一次的酒精清洗沉淀物,则可以去除游离的荧光物质。此法的优点是可以保留住极小分子量的片段,使第一个碱基就可以被读取出来,然而,其缺点是无法完全去除游离的荧光物质,会有较高的背景值影响序列判读。
(3)离心管柱纯化法:使用特殊的gel-filter,将定序反应产物小心地注入其中,经过低速离心,游离的荧光物会保留在gel中,流出液则完全不含游离的荧光物。此法的优点是结合前面两种方法的优点--既可以读取到第一个碱基,背景值也完全被清除干净,也相当省时(只需7分钟,前面2种方法约需1小时),然而,其缺点是昂贵。