生物样品前处理.pptx

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第二章生物样品前处理
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第一节样品分离的预提取
第二节细胞的破碎与分离
第一章绪论
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第一节样品分离的预提取(前处理)
前处理的目的:对目标组分进行初步富集,对干扰成分进行去除;

预处理材料的种类和特点
动物细胞反应液
植物细胞反应液
微生物细胞反应液
植物组织提取液
动物组织提取液
“发酵液”“产物”,胞内or胞外?
组织
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植物组织材料来源部位不同,前处理方法不同。
叶片、根、茎——清洗去泥沙、灰尘等杂质(-4°C——-30°C低温保存备用);
种子(大豆、莲子)、中药提取的原材料等——泡涨,粉碎。
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一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取,大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中,酶和酚类物质处于彼此隔离的状态,细胞组织被破坏后,彼此接触,很容易发生酶促反应,反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应,破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。

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例子:植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取
:
100g新鲜叶片→切成小片(打孔器、切片)→置入提取液中(稳定酶活性)→PVPP预浸泡(不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮,可溶性PVP聚乙烯吡咯烷酮,)→间歇高速搅拌(充分接触混匀)→纱布过滤→滤液加入PVPP重复轻搅(重复一次)→离心去除PVPP→酶粗提液。
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低温(4~5度),器皿、溶液预冷、操作要快;
5~7倍于固形材料的提取液,搅拌不产生气泡(气泡不利于酶活稳定);
~,中性,未知蛋白酶要远离等电点;
PVPP优良,不溶性;
PPO抑制剂,DTT、2-ME;
蛋白酶抑制剂PMSF(苯甲磺酰氟)酒精溶解,剧毒。
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重要活性多糖
步骤:原料→粉碎→醇醚回流脱脂→水提取→粗提液
去蛋白策略:Sevag法,蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性
TCA法,低浓度的TCA可沉淀蛋白质,离心后即可除去蛋白质。
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重组蛋白:工程菌可表达大量的重组目的蛋白,40%总蛋白含量,但易形成包涵体(蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中)。
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例:
:
酶解菌体细胞:离心收集菌体→溶菌酶→去核酸(DNaseⅠ)→电泳检测;
清洗包涵体:去除杂蛋白,保证包涵体蛋白不被溶解;
溶解包涵体:释放目的蛋白;
目的蛋白再折叠:恢复活性