纳豆芽孢杆菌答辩 课件.ppt

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专业:*****
研究生:*****
指导老师:*****教授
*****副教授
二○一四年五月二十二日
谷氨酸脱氢酶钙调机制研究
陕西师范大学硕士毕业论文答辩
汇报内容
研究背景与意义
1
谷氨酸脱氢酶钙调节机制研究
3
谷氨酸脱氢酶基因的验证
2
钙离子对发酵的调控作用
4
结论与展望
5
研究背景与意义
1
研究背景与意义
γ-PGA是由L-谷氨酸(L-glutamicacid)或D-谷氨酸(D-glutamicacid)单体通过α-氨基与γ-羧基缩合而成的多肽分子,其结构式如图所示。
微生物发酵法
化学合成法(γ-PGA、α-PGA)
γ-PGA
L-Glu
D-Glu
+
γ
α
γ
α
微生物
发酵
聚谷氨酸概述
研究背景与意义
聚谷氨酸产生菌
纳豆食品
纳豆激酶
聚谷氨酸
γ-PGA发现于1937年,从一种致病的革兰氏阳性细菌炭疽芽孢杆菌的荚膜中分离得到。其后发现了多种芽孢杆菌均能产生这种物质,主要包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。由于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的易培养性和生物安全性,目前对于这两种菌生产γ-PGA的研究报道较多。
在聚谷氨酸的发酵生产中,纳豆芽孢杆菌作为一类从纳豆发酵食品中分离出来的主要菌株,在生产食品级γ-PGA中发挥了巨大的作用。
纳豆芽孢杆菌
研究背景与意义
金属离子对聚谷氨酸发酵的影响
金属离子
生产菌株
调控作用
Mn2+
、-2
产生不同程度的γ-PGA的D-异构体;
延长细胞活力
K+

激发菌体细胞的生长及γ-PGA的产生
Mg2+

激发菌体细胞的生长及γ-PGA的产生
Na+

有效减少泡沫,降低粘度,改善溶氧及传质;降低γ-PGA的分子量大小
Ca2+
BacillussubtilisHSF1410
降低γ-PGA发酵液的粘度;提高γ-PGA产量;不会引起γ-PGA分子量的变化
表1-1不同金属离子对发酵的调控作用
研究背景与意义
L-Glu主要是由α-酮戊二酸和NH4+由GDH催化合成,接着,ATP被谷氨酸依赖的ATP水解酶水解为ADP和Pi,然后磷酸基团结合到小分子γ-PGA的C-末端,之后D-或者L-谷氨酸的氨基端与C端磷酸化了的小分子γ-PGA发生亲核攻击,生成Pi并延伸γ-PGA链。
前期研究发现,Ca2+添加后,菌体内α-酮戊二酸节点上的谷氨酸脱氢酶与未加入Ca2+相比,酶活显著提高,因此α-酮戊二酸更多地流向了与NH4+形成谷氨酸,合成更多的γ-PGA。
谷氨酸依赖的ATP酶
PGA聚合酶
聚谷氨酸的生物合成途径
图1-1γ-PGA生物合成途径
谷氨酸脱氢酶
研究背景与意义
α-酮戊二酸+NH3+NAD(P)HL-谷氨酸+NAD(P)
(NADH,NADPH,NAD(P)H三种辅酶依赖型)
GDH
Bacillussubtilis
谷氨酸脱氢酶微生物调控机制
立题依据
γ-PGA是一种由微生物发酵生产而得的高分子物质,具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性,因此在食品、农业、化妆品、制药业以及环保等领域应用非常的广泛。该研究以γ-PGA合成中底物谷氨酸供给调控机制为突破口,打破以往局限于γ-PGA合成酶及其调控的研究策略,不仅可初步阐明钙调节GDH活性和谷氨酸合成机制,而且为γ-PGA合成机制研究提供更广泛的理论和实验证据,也有利于为进一步提高γ-PGA合成水平提供人为控制的技术策略。
谷氨酸脱氢酶基因的验证
Strains/plasmid
Description
Source/reference

Isolatedfrom“natto”
黄柏祺,2010

F-endA1glnV44thi-1recA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169hsdR17(rK-mK+)λ–
Hanahan,1985
(DE3)
F-ompTgaldcmlonhsdSB(rB-mB-)λ(DE3[lacIlacUV5-T7gene1ind1sam7nin5])
Studier,.,1986
plasmids
pET28a(+)
ExpressvectorKmrT7lacHis-Tag(N,C)T7-tag11(I)thrombin
陕西省微生物研究所万一研究员
T-VectorpMD™19(Simple)
ClonevectorApr
Takara
表2-1菌株与质粒
实验材料
谷氨酸脱氢酶基因的验证
构建过程:PCR获得gdhA基因,TA克隆于T载体中;将表达载体与含目的片段的T载体分别经双酶切,T4连接酶过夜连接得到含目的基因的重组质粒。
体外表达:将重组质粒电击导入大肠杆菌BL21宿主菌中,经IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE法验证目的蛋白的表达。
图2-1pET28a/gdhA构建过程示意图
实验方法