酶类实验测定方法.doc

酶类实验测定方法
验方
李菁华 法实
一叶片相对含水量(RWC)采用烘干称重法测定
将叶片称鲜重(Fw)等量两份,然后一份浸入去离子水8h后称其饱和鲜重(Tw),将另一份材料于105℃烘箱中杀青30min,再在80℃下烘干48h至恒重记为干重(Dw),按如下公式计算
(Fw-Dw)
叶片相对含水量(%)×100%
(Tw-Dw)
.北京:中国农业出版社,2000
二根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定
一、原理
氯化三苯基四氮唑(TTC)是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素,溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙,生成的三苯甲腙比较稳定,不会被空气中的氧自动氧化,所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体,植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原,可因加入琥珀酸,延胡索酸,苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。
二、试剂
1)乙酸乙酯(分析纯)
2)连二亚硫酸钠(Na2S2O4),分析纯,粉末,俗称保险粉。
3)%TTC(又名红四氮唑、2,3,5-氯化三苯基四氮唑)溶液:,溶于少量水中,定容到100ml。
4)磷酸缓冲液(1/15mol·L,):
A液:称取纯Na2HPO4·2H2O 。
B液:称取纯KH2PO4 。
用时取A液60ml,B液40ml混合即成。
5)1mol·L硫酸:,边搅拌边加入盛有100ml蒸馏水的烧杯中,冷却定容至100ml。
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三、实验步骤
1)TTC标准曲线的制作:%,加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。、
、、、,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列,以乙酸乙酯作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线。
2)取出大豆根系洗净,用滤纸吸干水分,,放入10ml烧杯中,%TTC溶液和磷酸缓冲液各5ml,把根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1~3h(2h),此后加入1mol·L硫酸2ml,以停止反应。(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,
10min后其他操作同上)。
3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯3-4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎,以提出TTF。红色提取液移入试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2-3次,皆移入试管,最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色,以空白实验作参比读出吸光度,查标准曲线,即可求出四氮唑还原量-1
四、结果计算
四氮唑还原强度(mg·g根鲜重h)=四氮唑还原量(mg)/根重(g)×时间(h)
王晶英,敖红,张杰, .哈尔滨:东北林业大学出版社,
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三氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物岐化酶(SOD)
一、原理
SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD:Mn--SOD,它们都催化下列反应:
由于超氧自由基(O2)为不稳定自由基,寿命极短,测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2-..-,当加入NBT后,在光照条件下,与超氧自由基反应生成单甲臜(黄色),继而还原生成二甲臜,它是一种蓝色物质,在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时,可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和O2,从而抑制了NBT光还原的进行,使蓝色二甲臜生成速度减慢。
通过+
在反应液中加入不同量的SOD酶液,光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值,抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低。
二、试剂
1. (PBS,):
A母液:: 取Na2HPO4·12H2O(); B母液::取NaH2PO4·2H2O()。分别用蒸馏水定容到1000ml。
PBS()的配制: