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DNS法测定总糖和还原糖
实验九总糖和还原糖的测定(二)
──3,5-二硝基水杨酸法
一、目的要求:
掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。
二、实验原理:
在NaOH和丙三醇存在下,3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色,在540nm波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。
黄色桔红色
三、试剂和器材
1、试剂
(1)1mg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100ml,即含葡萄糖为ml。
(2)3,5—二硝基水杨酸试剂:称取g3,5—二硝基水杨酸并量取262ml2mol/LNaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中(182g酒石酸钾纳溶于500ml水中),再加5g结晶酚和5g亚硫酸氢钠溶于其中,搅拌溶解,冷却后定容到1000ml贮于棕色瓶中。
(3)碘-碘化钾溶液:称取5g碘,10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
(4)6NNaOH:称取120gNaOH溶于500ml蒸馏水中。
(5)%酚酞指示剂。
(6)6mol/LHCl溶液
2、材料
小麦淀粉或玉米淀粉。
3、器材
分光光度计,天平,水浴锅,电炉,试管若干等。
四、操作方法
1、葡萄糖标准曲线制作
取8支15mm×180mm试管,按下表加入ml葡萄糖标准液和蒸馏水。
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
葡萄糖标准液(ml)
0
蒸馏水(ml)
水杨酸溶液(ml)
葡萄糖含量(mg)
0
将各管溶液混合均匀,在沸水中加热5min,取出后立即用冷水冷却到室温,再向每管加入ml蒸馏水,摇匀。
λ=540nm处测定吸光度
以葡萄糖含量(mg)为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。
2、样品中还原糖的提取
(淀)粉,放在100ml烧杯中,先以少量蒸馏水(约2ml)调成糊状,然后加入40ml蒸馏水,混匀,于50℃恒温水浴中保温20min,不时搅拌,使还原糖浸出混。过滤,将滤液全部收集在50ml的容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,即为还原糖提取液。
3、样品总糖的水解及提取
(淀)粉,放在锥形瓶中,加入6mol/LHCl10ml,蒸馏水15ml,在沸水浴中加热,取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解毕,冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,以6NNaOH溶液中和至溶液呈微红色,并定容到100ml,过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中,定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液,用于总糖测定。
4、样品中含糖量的测定
试剂
空白
还原糖
总糖
样品溶液(ml)
0
蒸馏水(ml)
水杨酸(ml)
将各管溶液混合均匀,在沸水中加热5min,取出后立即用冷水冷却到室温,再向每管加入ml蒸馏水,摇匀。
λ=540nm处测定吸光度
样品溶液中还原糖和总糖
测定后,取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。
五、结果处理
按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量:
式中:C──还原糖或总糖提取液的浓度,mg/ml;
V──还原糖或总糖提取液的总体积,ml;
m──样品重量,g;
1000──mg换算成g的系数。
思考题

,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果,这两种方法各有何优点