大蒜SOD提取.doc

大蒜SOD提取
实验题目:大蒜中SOD提取及分离纯化
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(2)学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活的方法。
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超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内,可催化细胞内超氧负离子( O2-) 的歧化反应,使 O2-转化为 H2O2 和 O2。因此,SOD是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶,在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。
SOD是一种亲水性的酸性酶蛋白,在酶分子上共价连结金属辅基,按照其结合的金属离子,主要可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD 3种。Cu/Zn-SOD是分布最广而且是最重要的SOD,主要存在于真核细胞的细胞浆内,分子量约为32KD,一般由两个亚基组成。SOD对热、pH以及某些理化性质有很强的稳定性,即使温度达到60℃,经短时处理酶活几乎无损失;同时,酶活性不受乙醇和氯仿影响,但Cu/Zn-SOD对氰化物及过氧化氢均敏感。SOD不溶于丙酮,可用丙酮将其沉淀析出。Cu/Zn-SOD由于色氨酸含量低,其最大紫外吸收为258nm,由于含铜,所以在可见光680nm处有最大吸收。
国内测定SOD活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。在碱性条件下,邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物,同时
生成超氧负离子(O2-)。中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。邻苯三酚的自氧化速率与O2-的浓度有关。当有SOD存在时,由于它可催化超氧负离子(O2-) 的歧化反应,生成氧和过氧化氢: ,从而抑制邻苯三酚的自氧化,阻止了中间产物的积累。因此,可通过监测 SOD 对这个反应的抑制程度间接测定 SOD 活力。大蒜中的SOD正属于Cu/Zn-SOD。

实验材料:大蒜

[试剂和器材]:
材料: 市售新鲜大蒜.
仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管、研钵、烧杯、量筒、搅棒、高速离心机、葡聚糖G-75层析柱。
试剂: 硫酸铵固体、磷酸缓冲液(, ),EDTA()、 Tris-HCl 缓冲液(,内含2mmol/L EDTA): Tris(内含 4mmol/L EDTA)100ml 与 HCl 混合,加双蒸水至200ml,±、邻苯三酚(45mmol/L):以 10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液。 B[方法和步骤]
(1)SOD粗提取方法
取35g大蒜,去皮洗净后加入少量预冷的pH=( mmol/L的EDTA),冰浴研磨,用少量磷酸缓冲液冲洗研钵。将匀浆液于10000 r/min下离心20 ,于60℃水浴20 min,待其冷却后于
10000 r/min冷冻离心20 min,弃去沉淀,取上清液,测定体积,4℃冰箱中保存备用。
(2)SOD纯化沉淀分离方法(硫酸铵分级盐析法)
将硫酸铵晶体研磨成粉末后,称取一定质量的硫酸铵粉末缓慢加入SOD粗提
液,使之达到50%的饱和度,再放置于4℃