实验 电泳分离蛋白质实验.doc

实验电泳分离蛋白质实验
实验电泳分离蛋白质实验
1、实验目的
(1) 学习SDS-PAGE分离检测蛋白质的原理;
(2) 掌握SDS-PAGE不连续凝胶电泳分离检测蛋白质的操作方法。
2、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联试剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的一种三维立体网状结构的凝胶物质,是目前生化和分子生物学实验中常用的电泳支持介质。聚合反应时常用的催化剂或者引发剂有过硫酸铵、过硫酸钾及核黄素等物质。N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、3-二甲胺丙腈等物质可作为聚合过程的增速剂。以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳是依据蛋白质的分子量和带电性的差异而使不同分子量的蛋白质得到分离。通过不同的电泳方法,即可探求蛋白质分子的各种特性,如分子量、等电点、电荷分布、免疫行为、生化特性等。SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子去污剂,在电泳实验中作为变性剂和助溶剂,它能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质的二级和三级结构。在电泳样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚成多肽链。强还原剂如β-巯基乙醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合成带负电荷的蛋白质-SDS复合物,由于SDS带有大量的负电荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷,因而掩
盖了不同种类蛋白质分子间原有电荷的差异,使蛋白质分子均带有相同密度的负电荷。蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒。不同的蛋白质的SDS复合物的短轴长度基本上是相同的,。但长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。因此这种复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而主要取决于椭圆棒的长轴的长度,即蛋白质或亚基分子量的大小。
由于SDS电泳分离蛋白质分子时,电泳迁移率只取决与分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小,即蛋白质分子量的大小,因此凝胶浓度的选择尤为重要。%的条件下,在10%的凝胶中,蛋白质的分子量在25KD到200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。在15%的凝胶中,蛋白质的分子量在10KD至50KD之时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。因此,可以根据所测的分子量的范围选择合适的凝胶浓度以及相应的已知分子量的标准蛋白。
3、实验试剂及仪器
(1)实验试剂
丙烯酰胺(Acr),N,N′-甲叉双丙烯酰胺(Bis),N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED),十二烷基硫酸钠(SDS),甘氨酸,过硫酸铵(AP)(以上试剂均为电泳纯),β-巯基乙醇,Tris,丙三醇,三氯乙酸,冰醋酸,甲醇,考马斯亮蓝,盐酸(HCl),溴酚蓝,冰醋酸,标准分子量蛋白,未知分子量蛋白样品。
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(2)实验仪器
垂直板电泳槽一套,直流稳压电源(500伏、100毫安),抽气装置,凝胶成像系统,1mL、10~200μL移液枪各一支,滤纸,胶皮手套,细长针头(15cm)。
4、电泳工作液的配制
(1) 10%SDS溶液,250mL
取25g电泳级SDS,用双蒸水溶解后定容至250ml,室温下可长期保存。
(2)丙烯酰胺单体贮液,50mL