小型振荡瓶培养的制作方法.docx

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专利名称:小型振荡瓶培养的制作方法
小型振荡瓶培养本文报道了小型振荡瓶培养哺乳动物细胞的方法,其中振荡瓶内部培养基的条件通过振荡瓶的旋转速度和振荡瓶的外部气压来控制。
背景技术:
在开发例用哺乳动物细胞来生产重组多肽的生物技术生产工艺的过程中,有多个参数需要进行调节和优化。由于需要大量的单独实验,这种优化以小规模进行,优选在振荡瓶中进行。但由于大型搅拌培养器和小型振荡瓶在几何尺寸和反应条件上的差异,得到的小规模的结果不代表大型工艺的真实结果。这些差异是由化学、生化和加工工程的原因引起的。因此,总体目标是找出小型和大型工艺的条件例如细胞密度、产品浓度或尽可能好的产品质量之间的联系。为了使大型工艺和小型工艺尽可能具有可比性,必须评估各种差异对获得的结果的影响。例如,如果大型工艺是搅拌工艺,那么小型工艺最好也采用搅拌工艺。DE441M44报道了振荡瓶中摄氧速率在线测定的自动测定系统。((2005)698-708)报道了48孔微量滴定板的氧传递现象。(.(1996)C2072-C2080)报道了L-抗坏血酸调节肾细胞的生长与新陈代谢。Randers-((1996)466-477)
报道了在组织培养瓶中的非侵入性氧测量和传质考虑因素。((2006)2939-2949)报道了振荡生物反应器中的流体混合对于微量型微生物和哺乳动物细胞培养规模扩大化预测的意义。因此,需要在小型振荡瓶基础上设计大型搅拌哺乳动物细胞培养工艺,反之亦然。另一个目标是提供小型振荡瓶工艺,在其中实现培养基搅动和混合的小型机械搅拌。发明概述本发明的第一个方面是培养哺乳动物细胞的方法,包括-根据如下因素调节培养容器的机械运动速度i)培养基中的活细胞密度,和/或ii)培养基中的氧分压。在一个实施方式中,该方法包括一个或多个以下步骤a)培养一套培养容器-每一个容器的总容积最高为200μ1,或-每一个容器的工作容积最高为100μ1,或-每一个容器的总容积在25ml至3000ml之间,或-每一个容器的工作容积在IOml至1500ml之间,和/或b)通过整个培养容器的机械运动来搅动培养基,c)通过培养容器的外气相的二氧化碳浓度来调节培养基的pH值。在一个实施方式中,培养容器包含培养基和培养基上方的内部气相。在另一个实施方式中,培养容器包含将内部气相和外部气相分离的膜或帽或盖。在本发明方法的一个实施方式中,机械运动通过整个培养容器的旋转运动或整个培养容器的俯仰运动或整个培养容器的振荡来实现。在进一步的实施方式中,本发明的方法还包括d)通过非侵入性光化学传感器确定培养容器内的
pH值和p02。在另一个实施方式中,机械运动速度的调节如下i)根据起始细胞密度将机械运动速度设置为60rpm至IOOrpm,其中当细胞密度为IxlO5细胞/ml或更小时设置为60rpm,,当细胞密度为5x10s细胞/ml时设置为lOOrpm,或在中间细胞密度时设置为线性中间值,ii)活细胞密度每增加一倍,机械运动速度增加20rpm,直至细胞浓度达到20xl05细胞/ml,iii)活细胞密度每增加20xl05细胞/ml,机械运动速度增加20rpm,直至细胞密度达到80xl05细胞/ml,iv)活细胞密度由80xl05细胞/ml增加至细胞密度ΙΟΟχΙΟ5细胞/ml时,机械运动速度增加lOrpm。在一个实施方式中,机械运动的速度进一步调节如下ν)维持机械运动速度在200rpm至210rpm之间,逐步降低机械运动速度至135rpm,并保持该速度不变直到培养完成。在一个实施方式中,步骤ν)中机械运动的速度维持在200rpm至2IOrpm达18小时至30小时。在另一个实施方式中,步骤ν)中机械运动速度维持在200rpm至210rpm达约24小时。根据本发明方法的一个实施方式包括根据培养基中的氧分压来调节机械运动速度,以维持培养基中的氧分压处于或高于下限水平。在一个实施方式中,增加机械运动速度以增加培养基中的氧分压或降低机械运动速度以降低培养基中的氧分压。在一个实施方式中,为改变氧分压而对机械运动速度进行的改变是线性变化,或是多项式变化或是指数变化。在
一个实施方式中,氧分压的下限水平是25%空气饱和度。本发明的第二个方面是重组生产异源多肽的方法,包括以下步骤a)提供含有编码异源多肽的核酸的哺乳动物细胞,b)用本发明的方法培养所述哺乳动物细胞,c)从培养基中回收异源多肽。在一个实施方式中,异源多肽是免疫球蛋白,或免疫球蛋白片段,或免疫球蛋白接合物。在进一步的实施方式中,哺乳动物细胞是CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞或杂交瘤细胞。本发明的第三方面是非侵入性光化学传感器在本发明的方法中用于测定小型培养容器中的PH值和PA的应用。本发明的第四方面是本发明的方法用于确定在容积为1000L至25000L的搅拌培养容器中的大型培养的培养参数范围的应用。发明详述
本发明涉及在振荡瓶中培养哺乳动物细胞的方法,其中,用机械运动进行培养基的搅动,并通过运动速度和振荡瓶外部气压来控制pH、pO)2和p02。根据本发明的方法得到的细胞密度、成活力、活细胞密度、细胞生长曲线、体积产量、产品浓度和产品质量与在带有机械搅拌的总量为1000L至25000L的培养容器中的大型培养相当。因此,在本发明的方法中,培养基不通过直接与小型培养容器内的培养基接触的机械部件如机械搅拌桨或电磁搅拌棒进行搅动或混合。本文所用的术语“机械运动”是指使小型培养容器内的培养基运动、
即使其搅动或混合的方式。在一个实施方式中,机械运动通过使整个培养容器运动来进行,而不是使用直接与培养容器内的培养基接触的机械部件。生物技术生产工艺的开始是以获自冷冻细胞库的细胞培养作为初始培养。通过转移确定数量的细胞或确定体积的培养基至新的培养容器中将初始培养扩大,所述新的培养容器比之前使用的容器具有更大的培养体积并且在其中加入了新鲜的另外的培养基。所述培养可以在通过机械运动如振荡、俯仰运动等搅动或混合培养基的培养容器中进行。在具有一定培养量的情况下,优选采用机械搅拌来搅动和混合培养基,以最小化由于培养基的搅动和混合不充分而导致的培养容器内培养基组分的浓度差异。这种浓度差异可导致培养条件的不均勻,从而导致不同培养量下得到的培养结果缺乏可比性。因此,在不进行重大修改以及大量工作的情况下,小规模下获得的结果和确定的参数不能轻易转移到大规模培养中。为了能够从小型向大型转化,在过去已经确定了一些重要的参数-培养容器的几何可比性,如高径比,或内部构件如液体流断路器(折流板),-由类似尺寸的搅拌装置输入的类似的体积比能量,-类似的质量疏运,-类似的重要工艺参数控制如培养基中的氧分压、pH值、温度等。根据本发明的哺乳动物细胞小型培养尚未见报道。在该方法中,通过整个培养容器的机械运动来搅动和混合培养基。此外,氧气和二氧化碳分压以及与之相关的PH
值的控制可随之实现。当根据本发明的方法施行时,小型培养所产生的细胞密度和产品浓度与在机械搅拌的培养容器中的哺乳动物细胞的大型培养相似。本发明使用的术语“机械搅拌”或其语法等价术语是指机械部件如搅拌桨或搅拌棒直接接触容器中的培养基。使用本文所报道的培养方法,可以通过小型培养来确定大型培养中关于培养基PH值、温度、混合速度、气相的二氧化碳饱和度以及氧分压的时间进程的培养参数范围。本申请中所使用的术语“范围”是指很多小型培养过程中测得的参数最大值和最小值之间的范围。因此,通过根据本发明方法在容积为25ml至3000ml的培养容器中的小型培养,本发明的方法可用于确定在容积为1000L至25000L的搅拌培养容器中的大型培养的培养参数范围。在一个实施方式中,该方法就地使用非侵入性光化学传感器在线测定pH值和PA值即氧分压。在一个实施方式中,传感器位于振荡瓶的下部并且包括嵌入组织相容性聚合物中的荧光性分析物敏感染料,其可通过光纤读出。通过根据细胞密度调节机械运动速度可以调节液体培养基中的氧分压。机械运动速度可逐步或连续地调节。本申请所使用的术语“逐步”是指培养方法中的参数变化是立即的,即,直接从一个值变到下一个值。在“逐步”调节中,一个或多个参数在每次变化后保持改变的参数值直到方法中的下一个逐步调节或方法结束。本申请所使用的术语“连续”是指培养方法中的参数变化是连续的,即,参数值的变化是一系列小步骤,在一个实施方式中,每步的变化不大于参数值的
2%,在另一个实施方式中,不大于参数值的1%。在进一步的实施方式中,调节是连续和线性的。已经发现,从切105细胞/ml的接种细胞密度、IOOrpm的机械运动速度开始是很有利的,活细胞密度每加倍一次机械运动速度就增加20rpm,直到细胞密度达到20xl05细胞/ml;之后,活细胞密度每增加20xl05细胞/ml,机械运动速度就增加20rpm,直到最终细胞密度达到SOxlO5细胞/ml;之后,将机械运动速度增加lOrpm,以使活细胞密度由SOxlO5细胞/ml增加至ΙΟΟχΙΟ5细胞/ml。当细胞密度达到IOOxIO5细胞/ml之后,活细胞密度增加,但机械运动速度保持不变。在一个实施方式中,机械运动速度在最大值保持不变持续16至72小时。在另一个实施方式中,机械运动速度在最大值保持不变持续18至30小时,在一个实施方式中,持续约M小时。机械运动速度保持不变后,将其逐步降低至135rpm并保持不变,直到培养完成。更详细地,为5xl05细胞/ml时,机械运动速度设定到IOOrpm(rpm=每分钟的转数)。达到IOxlO5细胞/ml时,机械运动速度增加到120rpm;达到20xl05细胞/ml时,机械运动速度增加到140rpm;达到40xl05细胞/ml时,机械运动速度增加到160rpm;达到60xl05细胞/ml时,机械运动速度增加到180rpm;达到80xl05细胞/ml时,机械运动速度增加到
200rpm;达到100x10s细胞/ml时,机械运动速度增加到210rpm。之后,机械运动速度保持在200rpm士20rpm持续大约对小时。以后,机械运动速度降低至135rpm。在一个实施方式中是逐步降低,在一个不同的实施方式中是连续降低。在另一个实施方式中,机械运动速度的降低是连续和渐进的。达到135rpm的最终机械运动速度之后,机械运动速度保持不变直到培养完成,然后收获重组生产的多肽。改变机械运动速度允许增加或降低液相中的氧分压,其一方面取决于培养基中的活细胞密度,另一方面取决于培养阶段,即取决于培养是在指数增长阶段、稳定阶段还是生产阶段。本发明所使用的术语“线性”是指可表达为线性方程的两个参数的相互关系,如y=a^x+b,其中y和χ表示两个参数,a和b表示常数值。本发明所使用的术语“多项式”是指可表达为多项式方程的两个参数的相互关系,如y=a*x+b*x2+c*x3+d*x4+···,其中y和x表示两个参数,a、b、c和d等表示常数值。本发明所使用的术语“指数”是指可表达为指数方程的两个参数的相互关系,如y=a*ex+b,其中y和χ表示两个参数,a和b表示常数值,e为欧拉指数,,通过调节培养容器外部的二氧化碳分压来调节培养基的ρΗ值。由于气相压力和液相分压的关系,气态二氧化碳可以强制进入液相(气相中的压力上升)或者它可以从液相中(气相中的压力降低
)去除。由于二氧化碳在液体培养基中水化,它是碳酸氢根的来源,因此,提供了液相中的碳酸盐缓冲剂以调节液体培养基的PH值。在根据本发明方法的一个实施方式中,通过小型培养容器外的二氧化碳气压来调节液体培养基的ΡΗ,因此外部pC02的降低导致培养基的ρΗ上升,反之亦然。在一个实施方式中,培养是分批补料培养的方式。“蛋白质”是大分子,包括一个或多个多肽链或超过100个氨基酸残基的多肽链。蛋白质还可包括如碳水化合物基团的非肽类组分。碳水化合物和其他非肽类取代基可通过产生蛋白质的细胞加成到蛋白质上,并随细胞类型而变化。本文所定义的蛋白质是根据其氨基酸骨架结构来定义的;取代基如碳水化合物基团一般不明确指出,不过仍然可能存在。免疫球蛋白的重组生产在现有技术中是众所周知的,并描述在例如Makrides,.,(1999)183-202;Geisse,·,(1996)271—282;Kaufman,.,(2000)151—161;Werner,.,(1998)870-880的综述文章中。术语“免疫球蛋白”是指由一个或多个大量被免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。已经确定的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以各种形式存在,包括,例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双抗体(例如Huston,.
等人,(1988)5879-5883;Bird,,Science242(1988)423-426;通常,Hood等人,Immunology,.,第2版(1984);禾口Hunkapiller,,L.,Nature323(1986)15-16)。一般情况下,免疫球蛋白包括两条所谓的轻链多肽(轻链)和两条所谓的重链多肽(重链)。每个重链和轻链多肽都包含可变结构域(可变区)(一般为多肽链的氨基末端部分),其包括能与抗原相互作用的结合区。每个重链和轻链多肽都包含恒定区(一般为羧基末端部分)。重链的恒定区调节抗体与如下细胞的结合i)带有Fcγ受体(FcyR)的细胞,如吞噬细胞,或ii)带有新生Fc受体(Fcfoi)(也被称为Brambell受体)的细胞。它还调节与某些因子、包括经典补体系统的因子如免疫成分(Clq)的结合。免疫球蛋白的轻或重链可变区本身又包括不同的片段,即四个框架区(FR)和三个高变区(⑶R)。术语“免疫球蛋白接合物”是指包含至少一个通过肽键与另外的多肽结合的免疫球蛋白重链或轻链结构域的多肽。另外的多肽是非免疫球蛋白肽,如激素,或生长受体,或抗融合肽或补充因子等。术语“异源免疫球蛋白”是指不是由哺乳动物细胞自然生产的免疫球蛋白。根据本发明的方法生产的免疫球蛋白是通过重组方式生产的。这种方法在现有技术中是众所周知的,包括蛋白质在真核细胞中的表达以及随后回收和分离异源免疫球蛋白,并且通常纯化得到药学上可接受的纯度。为了生产,即表达免疫球蛋白,编码轻链的核酸和编码重链的核酸均通过标准的方法被插入到表达框中。编码免疫球蛋白轻链和重链的核酸很容易用常规程序分离和测序。杂交瘤细胞或