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多工试片的制作方法
本发明提供一种适用于各种类型的检测的多工试片。试片在不同的反应区可预先填充特殊配制的试剂,各反应在特别配制的试剂填充的不同反应区独立地进行。
【专利说明】多工试片
【技术领域】
[0001]本发明是有关于一种试验试片,且特别是有关于一种预先填充聚合酶链反应试剂的多工试片。
【背景技术】
[0002]在分子生物检验领域中,许多特定样品需要进行多种不同的实验或试验方法检测,有时需要针对一个样品进行多种项目检验。例如,在DNA的检测试验中,通过聚合酶链反应(PCR)检测测试,来检验一个样品中数种单核苷酸多态性(SNP)的基因型,或是检验一个样品中数个基因表现程度。实际诊断上会由几个DNA检验(assay)组成一个检验套组(panel),例如几种PCR检验组成一个癌症诊断的检验套组。PCR检验中每组检验试剂中至少包括两个特定的DNA引子分子(某些PCR检验中还额外包括目标特定的报导探针(reporterprobes)),这对引子(引子对)必须正确地与从要进行测试样品(样品)中所萃取的DNA模板混合,方能检验出样品中特定DNA目标是否存在或存在的量是多少。
[0003]传统上,引子对和样品置放于相同的反应容器以进行PCR。一般的置放方式通常是通过吸量管将单瓶储存的引子对、酶和dNTP混合物和缓冲液试剂以及样品一一以手动方式以吸量管移液到反应容器中。最常见的承载容器是96孔盘。利用前述置放方式,PCR检测至少需要两回合(两回)的吸量管移液操作,其中一回添加样品到反应容器中而另一回添加引子对到反应容器中。例如,假设利用一个检验套组来检查在一个样品中的36个目标,则需要至少36回移液操作以添加各自引子对到36个不同的反应容器中,另外需要36回移液操作以添加样品至上述各反应容器。此种操作方式不仅复杂容易出错,而且须耗用大量的人力。
[0004]另一种方法,所谓的多工法(multiplexingapproach),是在同一个反应区利用包括一个以上引子对的混合物来测试样品。通常情况下,一个反应容器中加入2?4种引子对。例如,如果一个容器中使用4种引子对时,以测试样品中的36个目标来计,将需要9个反应容器,添加引子对最少需要36回移液操作,加上需要9回移液操作来添加样品,总共需进行45回移液操作。其人力操作已经减少。但尽管多工法具便利性,同一容器内同时进行许多反应可能会导致反应和/或信号检测相互干扰,而使试验的准确性变差。因此,此种多工法难以在一个反应容器中使用多于6种引子对。
[0005]另一种方法是在工厂对个别反应容器预填充引子对。实验室使用者只需要添加样品到已经预先填充好的容器内。以前述例子,测试一个样品的36个目标,将只需要36回移液操作添加样品至预先填充好的36个反应容器中。如果同时采用多工法技术,过程甚至可能被进一步降低至只需9回移液操作。
[0006]此外,另一种方法是降低滴定盘板的反应容器体积至约纳升(nano-liter)的范围内,以节省试剂成本,其样式为类似试片的微滴定板。在微滴定板的反应容器(也称为微井或纳米井孔)的尺寸和体积太小,无法手动填充所用的引子对或样品而又能避免造成相邻反应容器之间的交叉污染(即引子对从一井散逸至其他井)。
[0007]另一种方法是提供具有微流体通道的微流芯片,其可以协助递送检测试剂(主要是引子对)和样品至各单独的反应孔进行独立反应。但是,微流芯片设计和制造不易且检测成本相当高。
[0008]还有一种方法是预先提供引子对至各纳米井并且固定引子于该纳米井的表面。因此,用户可以以单一移液操作或通过单一微流体通道来添加样品到各孔中,而不担心引子从一井散逸到其他井,使井与井之间的交叉污染降至最低。然而,引子固定后会限制其在反应容器内的运动,进而大大降低了PCR的效率。
[0009]总之,如果这些引子对或探针可以预先被放置在反应区,将可以大大简化人为操作。但是,只要检测反应涉及两个或多个反应区,同样的样品就需要分发到该反应的不同的反应区域,但预先填充的引子必须不能产生区域之间的交叉污染。
[0010]最重要的考虑是,每个反应容器中必须填充预定量的样品。然而,在样品填充过程中,各反应容器中不同的测试检测试剂不能相互交叉污染。传统的方法是,用移液吸管或针状分注器将样品逐个添加到反应井中。随着反应孔体积变小,井间的距离越接近,要将各孔中填充样品却不会产生交叉污染极具挑战性。若需要设计特殊的机械机构的分注器或路径,个别传送至每个反应容器是复杂且耗时的。至于具微通道的微流体装置,微流体装置的设计和微管道配制则会显著地增加生产成本。
【发明内容】
[0011]本发明提供了一种预先填充试剂的多工试片,以用于生物、生物化学或化学分析检测;特别是,用于聚合酶链反应;且更具体地,应用于即时聚合酶链反应。使用释放控制(release-control)的概念,运用特别配方设计的预充式试剂,在样品溶液填充到反应容器中的过程中(样品填充期间),允许试剂延迟释放。在样品填充期间结束后且PCR开始前,预充的试剂随后被释放到样品溶液中。因此,预先填充试剂的组成成分
(如引子和相关联特定的报导探针)将完全悬浮在混合物溶液中,故PCR的效率不会降低。但是,预充式试剂的组成成分在被释放之前具有类似固定化的性质,这将会使因样品填充操作而导致交叉污染的可能性下降。当反应孔中预先填充释放控制物质(控释物质)时,样品可以通过溢流法(overflow)、浸泡法(immers1n)、毛细吸入现象(capillarysuct1n)、真空吸引法(vacuumsuct1n)、刷涂或刮涂法(squeegee)涂布在反应试片上,以单一回移液操作在很短的时间内便能填充所有的反应孔/井。预装试剂的配方也应使预充式试剂保存和/或运输便利。
[0012]本发明提供了多工试片,其包括至少具有样品装载区域和多个反应容器的检测区域的一试片。其中该些反应容器布置为阵列,每一个反应容器具开口部和比开口部窄的底部,每一个反应容器中包括预充式试剂的配方(formulat1n)和控释物质。
[0013]根据本发明实施例,每一个反应容器有一个倾斜的侧壁连接开口部和底部。
[0014]根据本发明实施例,该预充式试剂的配方包括聚合酶链反应(PCR)的至少一对引子。此外,该预充式试剂的配方可包括报导探针(reporterprobes)。
[0015]根据本发明实施例,该控释物质包括甘油。甘油的重量百分比为20%或以上,该预充式试剂的配方变得粘稠且重力滑动率
(gravityslidingrate)小于5μηι/天。
[0016]根据本发明实施例,该控释物质包括聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇/聚氧化乙烯(PEG/PEO)、藻酸、天然淀粉或人工淀粉。
[0017]根据本发明实施例,该控释物质包括聚氨酯、琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺。
[0018]根据本发明实施例,该控释物质包括活性炭的微米颗粒或活性炭的纳米颗粒。
[0019]为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂,下文特举实施例,并配合附图作详细说明如下。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1A显示根据本发明实施例的例示性检测阵列板示意图;
[0021]图1B是根据本发明实施例的阵列板的反应容器的剖视示意图;
[0022]图2显示出根据本发明实施例的预充式试剂分注模式示意图;
[0023]图3A-3E显示出根据本发明实施例的检测试验的应用程序步骤示意图;
[0024]图4A显示本发明反应容器中具有荧光染料和甘油的预充式试剂所发出的荧光信号不意图;
[0025]图4B显示出添加样品溶液到已经有具有荧光染料和甘油的预充式试剂的反应容器后所发出的荧光信号示意图;
[0026]图4C显示出添加样品溶液到已经有具有荧光染料但不含甘油的预充式试剂的反应容器后所发出的荧光信号示意图;
[0027]图4D显示出经PCR40次热循环后,从装有样品溶液与具荧光染料和控释物质的预充式试剂的反应容器中所发出的荧光信号示意图;
[0028]图4E显示出经PCR40次热循环后,从装有样品溶液与具荧光染料但不含控释物质的预充式试剂的反应容器中所发出的荧光信号示意图。
[0029]附图标记说明:
[0030]10,20,30:检测阵列板;
[0031]32、100:检测区域;
[0032]102:反应容器;
[0033]102a:开口部;
[0034]102b:底部;
[0035]34、104:样品装载区域;
[0036]160a?160f:纳井;
[0037]22A、22B、22C:分注器;
[0038]20A、20B、20C:反应室;
[0039]320:反应井;
[0040]K:刮板;
[0041]R:预充式试剂;
[0042]S:样品。
【具体实施方式】
[0043]本发明提供多工试片或多工检测阵列板,可以广泛地应用于不同类型的反应检验。本发明提供一种预先填充可测试多种反应的试剂的检验试片,可以是玻璃微孔板或塑料微孔板。生产的检验试片板可以在不同的反应区中包括预充式检测试剂,而在填充有特殊配制试剂的反应区所独立进行的反应可以是相同的或不同的。本发明还提供了一种试剂的控释配方。根据本发明所配制的检验试剂的配方制剂可改善所用试剂长期保存,使所用试剂的运输和分配更容易。
[0044]下面的一些名词特提供说明。
[0045]“试剂”可指用于一个特定测试/检验的数种成分的配方或制剂。例如,在采用聚合酶链反应的试验中,检测试剂包括一对引子、酶、dNTPs、荧光报导物与盐类等。在应用程序中,不同的引子对和荧光报导物可能先被添加到反应容器中,再其次是样品与酶、dNTP和其它添加剂混合再加到反应容器中。
[0046]“样品”一般是指被测试的物品。例如,样品可以是农业标本、病理切片、土壤试样或从上述样品中提取的核酸片段
(包括DNA或RNA等)。
[0047]“分析”或“试验”可指对同一样品进行的一或多个实验或测试项目。例如,使用PCR来针对核酸样品检测300单核苷酸多态性(300SNP)基因型,该检测包括数种PCR检测项目,通过检查每个单核苷酸态性(SNP)的每个基因型(A、T、C、G)。例如,使用即时荧光定量PCR确定一个特定序列的核酸量。“样品溶液”或“样品混合物”指的是样品溶液与反应区中试剂的前述部分混合的混合物或混合溶液。
[0048]“反应容器”可指管盘的各个管、各反应管、微滴定板的孔或井,或测试试片或阵列板的凹坑/孔。如本文所述,“试片”、“试片板”、“检测阵列板”或“检测板”均可指容纳前述反应容器的同一衬底或衬板。
[0049]当在容器中的液体体积减小到一定程度时,在容器中的液体流动主要是由表面的附着力而非重力所控制。如果容器中的液体体积只有几纳升,该液体具有较高的表面粘附性会粘着到容器(纳井)上,也就是说,此时液体可以被视为粘接剂般稳定附着至容器底部或容器壁上。
[0050]较佳的,反应容器可以是试验试片或检测阵列板的单个反应孔或井。正如前面所讨论的,优选乃是使用更小的体积的反应容器,其尺寸例如从几纳升到几百纳升不等。
[0051]图1A显示根据本发明实施例的例示性检测阵列板示意图。如图1A所示,检测阵列板(或试片)10例如是:由聚碳酸酯
(PC)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成的试片且外形尺寸为36毫米X36毫米Xl毫米。该检测阵列板10具有一个检测区域100,其包含10,000个反应容器(纳井nanowells)102,。阵列板10并具有样品装载区域104。从阵列板10的剖视图(图1A的右侧部分)来看,纳井102具有较宽的开口部102a和较窄的底部102b。例如,每个矩形纳井102具深度100微米(dl),其开口部102a的尺寸:200微米(LI)X185微米(Wl)与底部102b的尺寸:(L2)(W2)。纳井102之间的距离或间距(Pl)可能范围为25?40微米,纳井102的倾斜侧壁的角度Θ例如大于90度,优选在100至135度之间,更优选在110至120度之间。。
[0052]图1B是根据本发明实施例的阵列板的反应容器的剖视示意图。在图1B中,阵列板10的反应容器可以设计具有不同的形状或配置方式。例如,纳井160a?160b乃是在检测阵列板10内形成的凹槽但没有贯通检测阵列板10。纳井160b/160d/160f具有倾斜侧壁。纳井160c?160f贯穿检测阵列板10而在检测阵列板10的顶面和底面上有两个开口端。由于毛细作用,样品液体能稳滞于纳井160c?160d中。纳井160d穿透检测阵列板10且在检测阵列板10的顶面和底面上具有两个开口端,并有倾斜的侧壁连接的两个开口端。