犬细小单抗.doc

犬细小单抗
一、复苏SP2/0和传代
预热不完全1640培养液和完全1640培养液。取出液氮保存的SP2/0细胞,液氮一定要挥发完,置于37℃温水中融化细胞,融化中摇动细胞管。吸取不完全RPMI-1640 10ml于15ml离心管中,巴氏吸管吸出冻存细胞液。1000rpm 10min离心。倒掉离心管中的上清液,加入预热的完全1640液10ml悬浮。悬浮的细胞液转入细胞培养皿,37℃5%CO2培养。吸弃去培养上清液,吹打细胞,分装到不同的细胞皿中,加细胞培养液培养。二、抗原制备及纯化
1. 抗原的制备
CPV病毒液的繁殖将生长至单层的F81细胞(75T)弃培养液,3ml胰酶洗2遍,弃胰酶,置于37℃培养箱,残留胰酶消化3min,加入9ml培养液终止,反复吹打均匀,1:3传代(培养液为RPMI-1640加10%%的三抗,%的胰酶),按10%的量同步接种犬细小病毒液。3d 后待细胞病变80%以上时收毒,-20℃贮存备用。
2. CPV 的纯化
将收获的CPV细胞毒30mL反复冻融 3 次后,3000 r/ min 离心30 min后去沉渣,收集上清液。取600μL新鲜猪红细胞泥加入该上清液中,混匀,4℃下2 h。4℃2000 r/ min离心10 min后弃去上清。用10mLPBS重悬红细胞,37℃水浴4h,20min振摇1次,最后2000r/ min离心10min后收取上清,,-20℃贮存备用。
3. 抗原HA的测定
的PBS做1:10倍稀释,在一次性血凝板上用PBS按1:2、1:4、1:8…倍比稀释已稀释过的病毒液,用新鲜的 1%猪红细胞作血凝试验,每孔加红细胞悬液50μL,于4℃静止2h后判定结果,以50%的红细胞凝集为终点,出现凝集终点的最高稀释倍数判为该抗原的 HA 效价。
四、杂交瘤细胞制备

1) 融化或配制HAT存贮液,预热不完全1640培养液和完全1640培养
液。
2) 取正常Balb/c雌性小鼠,眼球采血,处死,75%酒精浸泡3~5min。
3) 浸泡完毕的小鼠,置入超净台,放入细胞培养皿中,酒精棉擦干皮
肤,镊子提起皮肤,剪刀剪开,暴露腹膜。
4) 5ml注射器吸取不完全1640培养液4ml/支,每只小鼠3支。
5) 打开15ml离心管盖子,镊子提起腹膜,注射1640液,酒精棉球按
压小鼠腹腔,吸出1640液至15ml离心管中,1000rpm 10min离心 1
次。
6) 配制HAT完全1640培养液,排枪加100ul/孔,计算需要总量。
7)离心后细胞加HAT完全1640培养液至所需体积多5ml左右,巴氏吸
管滴加1滴/孔,此时96孔板150ul/孔,因此SP2/0融合后细胞仅需50ul/孔,从而减少融合后的工作量。一般1只小鼠可以制备4板饲养细胞。
骨髓瘤细胞悬液的制备
融合前3d下午传代时将细胞密度调至20万/皿,融合前一天下午换液,融合当天上午将骨髓瘤细胞从CO2培养箱中取出,镜下观察细胞生长状况,取对数生长期细胞,且生长状态良好的细胞,在超净台内将上清丢弃,加入新鲜的不完全培养基,清洗残余的废液后,重新加入1640基础培养基,用弯头吸管轻轻反复多次吹打细胞贴附的瓶壁,直至全部吹起细胞,将骨髓瘤细胞悬液合并于50ml玻璃圆底离心杯中,盖紧瓶盖,在室温下以1000rpm离心5min,弃上清,再用10ml基础培养基重新悬浮后计数。

1) 准备50ml离心管、细胞培养皿、不完全1640培养液、HAT完全1640
培养液。
2) 处理SP2/0,显微镜下观察,四皿共加40ml 1640液,吹打,移至50ml
离心管中。
3) 选定融合小鼠,摘眼球采血,处死,75%酒精浸泡,移入超净台,剪
开皮肤,撕开皮肤露出腹膜,取出脾脏。
4) 洗涤一次,移入预先加1640液的平皿中,置于200目筛网上,5ml注
射器芯研磨。将筛网两面的细胞洗到培养皿中,移入50ml离心管。
5) SP2/0,脾细胞一起离心,1000rpm, 10min。
6) 倾倒掉上清液,加不完全1640液体悬浮Sp2/0和脾淋巴细胞(一个
96孔板铺1000万的脾细胞和100万的瘤细胞)。
7) 将脾淋巴细胞加入Sp2/0细胞中,1000rpm,10min。
8) 倒掉上清液,倒不干净的用200ul移液器吸走。
9) 取出终止1640和PEG1500。
10) 打松离心后的细胞,置入37度水中预热一会,计时20Min。
11) 巴氏吸管吸