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生产及展望
自然界中存在的核苷酸共有 11种,其中 4种比
较常见,7种较稀有。核苷酸是一类在代谢极为重要的生化物质。除作为 DNA、RNA的前体外,在细胞的生长代谢、能量的储存和转化、免疫反应及信号传导中,都有核苷酸的参与。核苷酸在食品行业中,已经由最初的食品助鲜剂,扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂,特别是在婴幼儿食品中,核苷酸能有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力,减少腹泻的发生。同时,核苷酸在抗癌,抗病毒,治疗心血管疾病、糖尿病及干扰诱导等方面具有独特的疗效,被用于多种药物的合成。作为医药中间体,核苷酸主要用来制造腺苷三磷酸(ATP)、环腺苷酸、胞二磷胆碱
聚肌胞、氟铁龙等抗病毒、抗肿瘤、治疗心血管疾病药物。据统计,目前核苷酸类物质可以合成 52种抗病毒、抗肿瘤药物。而这些药物有望成为继磺胺类药物抗生素之后的又一类新型的抗病毒、抗肿瘤药物。此外,核苷酸还可作为农用激素调节植物生长,用于农作物的生产,有明显的增产、增重功效。
20世纪 60年代,日本的国中明率先发现了利用橘青霉(Penicillium citrinum)提取的 5’_磷酸二酯酶
可以降解 RNA生成 5’_核苷酸,随后,日本利用该方法首先开始了核苷酸的工业化生产。在几十年的研究中,已形成生产核苷酸及其衍生物的多种方法,归纳起来主要有 4种:化学合成法、RNA酶解法
、微生物发酵法以及生物催化法。
1生产工艺

化学法生产核苷酸,通常是磷酸或者焦磷酸的活
性衍生物对核苷酸进行磷酸酯化反应。一般常用的焦磷酸的活性衍生物有三卤氧化磷、焦磷酰氯、双一对硝基苯焦磷酸等。另外,要得到 5’一核苷酸,必须在磷酸化反应前以适当的保护基保护核苷上核糖的 2’,3’羟基。一般采用乙酰基、苄基、‘I)一亚异丙基或苯亚基的功能化基团保护。
目前已知的核苷酸化学合成方法主要有:
(1)Ott法
以 5’一核苷单磷酸三正丁胺盐与过量的 1,1’一碳二酰咪唑于室温下反应 1h,活化生成 5’一核苷单磷酰咪唑,将未反应的 1,1’一碳二酰咪唑用甲醇除去;5 核苷单磷酰咪唑与焦磷酸盐反应生成 5’一核苷三磷酸。
反应产物用二乙胺基乙基(DEAE)阴离子纤维树
脂层析柱分离纯化。采用 0~,所得的核苷酸三乙铵盐用甲醇溶解,加入
高氯酸钠转型成钠盐。
(2)Ludwig法
将 POCI3加入到 mmol核苷悬浮液中,0℃搅拌 。反应混合物中加入 2mL浓度为
/L的焦磷酸三正丁铵盐
N,N一二甲基甲酰胺(DMF)溶液和 Bu3N,迅速剧烈搅拌。lmin后加入 pH值为 。反应产物用 DEAE纤维树脂层析分离,洗脱剂为碳酸三乙铵盐,0~,得到核苷酸三乙铵盐。
化学法合成核苷酸经历的步骤多、路线长,立体
选择性差,所涉及的试剂昂贵,并有一定毒性,生产成本较高。因此一般仅限于实验室规模生产一些有特殊用途的核苷酸的衍生物,难以达到工业规模。
解法
20世纪 60年代,日本科学家发现,可以用从橘
青霉中提取的 5’一磷酸二酯酶降解 RNA生成 5’一单核苷酸,从而生产具有呈味作用的 5’一鸟嘌呤核苷酸(GMP)。从 1961年起,以酵母 RNA为原料,利用橘青霉和金色链霉菌生产 5’一磷酸二酯酶降解 RNA,开始了5’_GMP的工业化生产。目前,在日本有 40%的核苷酸是以 RNA为底物酶解得到的。
酶解法生产 5’一核苷酸的工艺流程为:酵母经稀
碱或浓盐抽提后,在 pH值为 RNA。再经 5’一磷酸二酯酶酶解,得到 4种核苷酸的混合液,将该混合物经离子交换树脂分离纯化可以得到4种核苷酸的纯品。其中磷酸二酯酶主要是通过橘青霉固体发酵生产的核酸酶 PI。它是一个胞外酶,提取后的粗酶液酶活一般在 -(即400- 700U/mL),可以直接用于水解核酸
,其水解率一般为 70%~85%,由于酶解反应水解率不高,水解液中除了 4种核苷酸外,还存在大量的杂质。一次性分离 4种核苷酸本身难度就大,加上其他杂质,使得后续工艺对 4种核苷酸的分离非常困难。
徐焱通过对原始菌株的筛选,得到一个酶活可达
(即 1000U/mL)以上的橘青霉菌株,并改变了传统的固体发酵方式,用新型气升式反应器液体发酵生产核酸酶 PI,酶解率达到 90%,从而减轻了分离工艺的压力。
除了橘青霉的核酸酶 PI外,还可从麦芽根中提
取磷酸二酯酶进行酶解