细胞学实验设计.doc

细胞学实验设计
细胞生物学实验设计方案——
不同温度对细胞活性的影响
实验目的:
1、验证细胞培养过程中温度对细胞活性的影响
2、学会使用MTT法检测细胞活性。
实验原理:
四唑盐比色实验(MTT法)是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用显色试剂四唑盐(MTT)是一种能接受氢原子的染料。MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时,线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲瓒(Formazan),将结晶的甲瓒溶解释放,再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值,OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。活细胞多则吸光度大,反之则吸光度小,从而反映出细胞的存活及增殖情况。由此可通过检测在不同温度细胞的活性变化,从而验证细胞培养过程中温度对细胞活性的影响。
实验器材:
1、实验仪器:96孔培养板(单层生长的细胞选用平底型培养板,悬浮生长的细胞选用圆底型培养板)、移液器、吸管、离心管、血球计数板、孵箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪、离心机
2、实验试剂:MTT溶液(称取250mg MTT,放入小烧杯中,加
50ml , ,在电磁力搅拌机上搅拌30min,,分装,4℃保存。两周内有效。)、含l0%胎牛血清RPM1640培养液、%胰蛋白酶消化液、二甲基亚砜(DMSO)
实验步骤:
1、接种细胞:%胰蛋白酶消化单层培养细胞,再用含10%胎牛血清的RPMl604培养液配成单个细胞悬液,以每孔100-1000个细胞接种于2个96孔培养板中,每孔体积200ul。
2、培养细胞:将培养板1移入CO2孵箱中,在37℃、5%CO2及湿度条件下,培养3—5天。将培养板2移入CO2孵箱中,在25℃、5%CO2及湿度条件下,培养3—5天。将培养板1移入CO2孵箱中,在42℃、5%CO2及湿度条件下,培养3—5天。
3、呈色:培养第2—5天后,每孔加入MTT溶液(5mg/m1)20ul,对应温度下继续孵育4h,终止培养,小心吸去孔内培养上清液;对悬浮生长的细胞,
需离心(),然后弃去孔内培养液。每孔加入150ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解。
4、比色:选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上调定各孔收值,记录结