荧光原位杂交的染色体分析.doc

荧光原位杂交的染色体分析
,依次用70%、90%和100%的乙醇脱水5min。
。
,载玻片可在室温贮存数天。若载玻片要长期保存,应在室温下过夜使组织“老化”(aged),然后放入容器中,该容器密封于含干燥剂的塑料袋内,-70℃保存。根据作者的经验,在6个月内使用的载玻片可贮存在-20℃。在杂交实验之前解冻这些载玻片,不提倡反复冻融载玻片。
(二)缺口平移法标记探针
通过缺口平移法生物素(酰)化DNA探针
:2μg探针DNA,10μl 10×反应缓冲液,10μl β-巯基乙醇,10μl核苷酸母液( dATP, dCTP, dGTP, -16- dTTP),20单位DNA聚合酶I和1:1000稀释的DNase I,加双蒸水至100μl(最后加酶)。
℃温育2h。
。
:取10μl反应混合物,加入凝胶上样缓冲液,水浴箱中煮沸2~3分钟使其变性,冰浴3min,上样到1~2%的琼脂糖微型凝胶中,并以适当大小的标准品做对照,以50V/cm电泳3min。,在紫外透照仪上显示DNA并拍照。
,探针(可见一脱尾)应为100
~500nt。根据电泳结果进行下述步骤:
a. 如果探针大小在期望的范围内,进行步骤6。
b. 如果探针太大,可加入更多的DNase I,在15℃温育。
c. 如果探针未完全消化,纯化探针并重复缺口平移法。
d. 如果探针太短,用较少的DNase重复反应。
,加入2μl EDTA和1μl SDS,在68℃加热10min。
:
a. ,加经缓冲液平衡的Sephadex G50至1ml刻度处,将此柱置15ml的离心管内,室温下,
3000r/min离心6min。
b. 去除过柱后的液体,加入缓冲液重复离心直至柱内容物紧密充填至1ml刻度处,加100μl柱缓冲液,3000r/min离心6min,重复洗涤步骤3次。在最后一步洗涤后,确保流量与上样缓冲液量相等,即100μl。
c. 探针溶液离心之前,,与前面步骤相同,加探针液到柱内并离心,过柱后的液体收集在反应管中,这时已含有20ng/μl的标记探针。该探针已可用于原位杂交或贮存于-20℃。
用缺口平移法进行地高辛标记
与缺口平移地生物素化法几乎相同,仅10×寡核苷酸母液成分不同: dATP, dCTP, mmol/L dGTP, mmol/L地高辛-11-dUTP, dTTP。
(三)斑点印迹分析法检测标记物
。
℃真空烤箱内