项目十九 吞噬细胞功能检测.doc

项目十九吞噬细胞功能检测
一、中性粒细胞吞噬功能测定(Neutrophil phagocytosis assay)
(一)吞噬试验
【实验原理】
中性粒细胞具有吞噬功能,当与颗粒物质(如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等)混合孵育一定时间后,颗粒物质被吞噬。根据吞噬率和吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能。
【试剂和器材】
20%FCS RPMI-1640培养液、 PBS、Wright染液、金黄色葡萄球菌培养物、抗凝剂(4g/L柠檬酸钠溶液)。
37℃温箱、显微镜、滴管、一次性采血针、微量细胞培养板、无菌干棉球、酒精棉球、碘酒棉球、接种环等。
【步骤和方法】
,用无菌生理盐水洗下菌苔,用PBS洗涤2次,100℃加热15min灭活。取热灭活金黄色葡萄球菌混悬于20% FCS RPMI-1640培养液中, 用比浊法调整浓度至6×107/ml。4℃保存,备用。
(约50μl)抗凝剂,无菌采人末梢血2滴(约100μl)与抗凝剂混匀。
×107/ml金黄色葡萄球菌悬液2滴(约100μl),混匀。
℃烛缸或5% CO2孵箱内培养30min。
,自然干燥,Wright染色,水洗,干燥,油镜镜检。
【结果判定】
计数200个中性粒细胞,并分别记下吞噬细菌的细胞数和各个细胞吞入的细菌数。计算吞噬率和吞噬指数:
200个中性粒细胞中吞噬细菌的中性粒细胞数 100%200
200个中性粒细胞吞噬的细菌总数 200
【注意事项】
。
,计数时应取片子前、中、后三段计数,以提高准确性。
,过高则抑制吞噬功能,过低使血液凝固。
【方法评价】
此法易操作、不需特殊设备,省时,费用低廉。结果直观,可用于评价其他方法获得的结果,但是光学显微镜分辨率低,有时难以计数吞入的细菌颗粒。
【临床意义】
本试验可用于检测有吞噬功能障碍的病症,如结合NBT试验,在一定程度上可反映机体的免疫功能状态,也可用于有免疫调节活性药物的筛选。
【思考题】
。
?
(二)硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验
【实验原理】
细菌感染时,中性粒细胞糖分解代谢活性增强,糖氧化过程中所脱的氢可被吞噬的或渗透到中性粒细胞胞浆内的NBT(nitro blue tetrazolium)染料接受,使淡黄色的NBT还原成蓝黑色的甲(formazan),以折光性很强的点状或斑块状颗粒沉积于中性粒细胞的胞浆内,在光学显微镜下易被识别,借此可以测定中性粒细胞的杀菌功能。
NBT还原反应的结构式如下:
C
RH2CH
四氮唑基甲基
【试剂和器材】
(Sigma产品) NBT,加入100ml % NaCl,用超细玻璃滤器过滤;小量分装,冰冻保存。
%沙黄O(safranin O,Fisher产品)染液取1g沙黄O加入100ml蒸馏水和40ml甘油。
NBT染液。
、甲醇等。
37℃温箱、显微镜、载玻片、盖玻片、湿盒、一次性采血针、酒精棉球、无菌干棉球等。
【步骤和方法】
。
,置37℃温育20min。
。
,滴加1滴培养液,将盖玻片反扣在培养液上。
,置37℃温育30min。
,空气中快速干燥。
,用蒸馏水洗涤。
%沙黄O染液染色5min,水洗,放在载玻片上镜检。
【结果判定】甲阳性细胞体积大,母细胞样,与正常形态PMN不同,它们充满蓝色沉淀物。
正常人甲阳性PMN≥30%。
【注意事项】
,不要残留颗粒;注意保存,不要被细菌污染。
,避免玻璃表面因素增加NBT的还原作用。
,以免将中性粒细胞冲掉。
【方法评价】
该试验方法简单、快速、便于重复,但易出现假阳性和假阴性结果。
【临床意义】
此试验为慢性肉芽肿病人检测的筛选试验,这些病人无甲阳性细胞,疾病隐性携带者结果小于正常人。此外,细菌感染
(尤其是全